Conservazione dei tessuti con paraffina fissata in formalina (FFPE): un metodo per studiare la morfologia dei tessuti

- Per prima cosa, posizionare una fetta di tessuto su una carta da filtro imbevuta di PBS per prevenire il restringimento o il rigonfiamento delle cellule bilanciando l'osmolarità. Trasferire il tessuto in una cassetta istosanitaria. Chiudere e posizionare la cassetta in formalina neutra tamponata, soluzione NBF. L'NBF contiene formaldeide che si lega a gruppi amminici di aminoacidi e previene la formazione di acido formico che pigmenta il tessuto. Lasciare la cassetta per una notte a bassa temperatura, che impedisce la degradazione dell'acido nucleico e fissa il tessuto. Disidratare il tessuto con più lavaggi di alcol.

Metterlo nella paraffina liquida e premerlo fino al fondo dello stampo. Rimuovere il peso e posizionare la parte inferiore della cassetta istografica sul fazzoletto. Versare la paraffina liquida sul gruppo. Lasciare solidificare la configurazione su una piastra fredda. La paraffina è insolubile in acqua e, dopo essere entrata nel tessuto disidratato, si indurisce e aiuta nel sezionamento. Trasferisci il blocco di tessuto su un microtomo. Tagliare e raccogliere sezioni sottili del tessuto su un vetrino. Se la sezione è troppo spessa, l'ossigeno e gli altri nutrienti non possono diffondersi attraverso la fetta creando un falso gradiente di necrosi. Se la sezione è troppo sottile, tende ad arricciarsi. Il video del protocollo esamina l'espressione dei biomarcatori e la vitalità cellulare dei tessuti FFPE del cancro del polmone.

- Per iniziare a fissare la fetta desiderata, trasferirla con una pinza in un piatto da 10 centimetri contenente una carta da filtro imbevuta riempita con 2 o 3 millilitri di PBS e lasciarla galleggiare. Quindi sollevare la carta da filtro con un paio di pinze e metterla in una cassetta histo. Trasferire la carta da filtro in una cassetta histo. Aggiungere una goccia di ematossilina diluita sopra la fetta di tessuto per segnare la posizione della fetta per i passaggi successivi. Chiudere la cassetta e trasferirla in una soluzione di formalina tamponata neutra al 4% e lasciare riposare per una notte a 4 gradi Celsius. Dopo il lavaggio e la lavorazione della cassetta come descritto nel protocollo, aprire la cassetta histo e utilizzare un bisturi per sollevare con cautela la fetta fissa dalla carta da filtro. Scartare la carta da filtro e trasferire la fetta in uno stampo contenente paraffina liquida.

Utilizzare un peso piatto per premere il tessuto contro il fondo dello stampo di inclusione per garantire un sezionamento uniforme. Posizionare la parte inferiore della cassetta histo sopra lo stampo, aggiungere sopra la paraffina liquida e lasciare raffreddare lo stampo su una piastra fredda per 30 minuti. Successivamente, separare lo stampo raffreddato dal blocco di paraffina. Utilizzare un microtomo per preparare sezioni sottili di 4 micrometri dei blocchi di fetta di tessuto FFPE. Elimina l'eccesso di paraffina che circonda il tessuto. Per ottenere sezioni uniformi in tutto il tessuto, regolare l'angolo del blocco in modo che la superficie del blocco sia orientata orizzontalmente rispetto alla lama. Utilizzando un pennello sottile, raccogliere sezioni sequenziali di tessuto della fetta di tessuto inclusa nella paraffina a partire dalla parte superiore dei vetrini. Continuare a raccogliere le sezioni degli strati di tessuto più profondi al centro, seguite dalla parte inferiore dei vetrini.

- La raccolta di sezioni da diversi strati di ciascuna fetta di tessuto ai vetrini dell'oggetto viene eseguita per consentire la cattura di potenziali gradienti indotti dalla coltura in vitalità, migrazione cellulare o espressione di biomarcatori.

- Dopo aver raccolto le sezioni, proseguire con la loro elaborazione e ulteriore analisi come descritto nel protocollo.