JoVE Encyclopedia of Experiments
Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 3:20 min • April 30th, 2023
- Le onde ultrasoniche a bassa frequenza portano alla lisi selettiva delle cellule leucemiche umane e il test XTT aiuta a determinare l'entità di questo danno. Il test funziona secondo il principio che gli enzimi mitocondriali delle cellule sane convertono un colorante giallo XTT in un composto arancione chiamato formazano. Per iniziare il test, trattare le cellule con metilbeta-ciclodestrina, un agente che riduce il colesterolo, e successivamente sonicare le cellule a bassa potenza per indurre il danno cellulare.
Centrifugare per pellettizzare le cellule e aggiungere nuovi terreni di coltura cellulare al pellet. Seminare le cellule alla concentrazione desiderata in una micropiastra a più pozzetti e incubarla durante la notte. Ora, aggiungere la soluzione XTT attivata alle cellule e incubare fino a quando il colore arancione non si sviluppa nei pozzetti della micropiastra. Posizionare la piastra in uno spettrofotometro. Misurare l'assorbanza a 450-500 nanometri e poi a 630-690 nanometri. Sottrai i due valori per ottenere risultati precisi. Il valore più elevato di assorbanza nel test XTT indica una maggiore attività degli enzimi mitocondriali e una maggiore vitalità cellulare.
Nel seguente video, dimostreremo l'uso del test XTT per determinare l'efficacia delle onde ultrasoniche a bassa frequenza nel causare danni cellulari nelle cellule leucemiche trattate con metilbeta ciclodestrina.
- Per valutare la vitalità delle cellule sonicate mediante saggio XTT, sonicare le cellule utilizzando un intervallo da uno a tre impulsi di un secondo, a distanza di un secondo, per sviluppare un intervallo di danni da valutare per il kit XTT. Quindi centrifugare le cellule e risospendere i pellet a 1 volte 10 al quinto cellulare per millilitro in un terreno di crescita appena preparato. Successivamente, seminare 100 microlitri di cellule per pozzetto in piastre per microtitolazione a fondo piatto da 96 pozzetti in triplice copia, inclusi tre pozzetti di controllo contenenti 100 microlitri di terreno di crescita completo da solo per le letture dell'assorbanza in bianco. Incubare le cellule per 24 ore.
La mattina del test, agitare delicatamente aliquote di XTT riscaldato a 37 gradi Celsius e reagenti di attivazione fino a quando le soluzioni non sono limpide. Quindi aggiungere 0,1 millilitri di reagente di attivazione a un'aliquota di 5 millilitri di reagente XTT. Successivamente, aggiungere 50 microlitri della soluzione XTT attivata a ciascun pozzetto delle piastre inoculate U937 e THP1 e rimettere le cellule nell'incubatore per colture cellulari. Dopo due ore, agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente il colorante arancione nei pozzetti positivi e misurare l'assorbanza su un lettore di piastre per microtitolazione tra 450 e 500 nanometri. Infine, misurare nuovamente l'assorbanza di tutti i pozzetti del saggio tra 630 e 690 nanometri.