JoVE Encyclopedia of Experiments
Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 3:24 min • April 30th, 2023
- La bromodeossiuridina o BrdU è un analogo nucleosidico sintetico della timidina. Durante la fase di sintesi del ciclo cellulare, BrdU sostituisce la timidina e si integra nel DNA appena sintetizzato. Il BrdU incorporato consente il monitoraggio della progressione del ciclo cellulare. Per rilevare il BrdU incorporato, in primo luogo, fissare e permeabilizzare le cellule per renderle permeabili.
Successivamente, trattare le cellule con l'enzima DNAsi per scindere i filamenti di DNA ed esporre il BrdU incorporato. Successivamente, aggiungere un anticorpo anti-BrdU marcato con fluorescenza adatto. L'anticorpo entra nel nucleo e si lega facilmente al BrdU esposto presente nel DNA.
Inoltre, trattare le cellule con un colorante fluorescente adatto che lega il DNA. Il colorante si lega al DNA, consentendo la quantificazione del contenuto totale di DNA. Utilizzare la citometria a flusso per rilevare la fluorescenza sia dal BrdU marcato che dal DNA.
Le intensità di fluorescenza del DNA marcato differenziano le cellule in diverse fasi del ciclo cellulare in base alla variazione del contenuto totale di DNA. Il segnale fluorescente proveniente da BrdU identifica l'attuale posizione del ciclo cellulare delle cellule incorporate in BrdU.
In questo esempio, eseguiremo la colorazione immunofluorescente BrdU di cellule di leucemia linfoblastica acuta NALM-6.
- Prima della colorazione degli anticorpi, trattare le cellule con DNAsi. Risospendere le cellule in 100 microlitri di soluzione di DNAsi e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio, centrifugare le cellule ed eliminare il surnatante. La colorazione degli anticorpi per marcatori intracellulari diversi da BrdU può essere eseguita contemporaneamente alla colorazione di BrdU.
- È importante predisporre controlli di compensazione costituiti da cellule non colorate e cellule marcate con ogni singolo fluorocromo. Idealmente, per i controlli di compensazione, utilizzare gli stessi anticorpi utilizzati nelle provette sperimentali.
- Risospendere le cellule in 50 microlitri di tampone di lavaggio con un microlitro per 10 alle 6 cellule dell'anticorpo BrdU. Se si utilizzano anticorpi contro altri antigeni intracellulari specifici, questi devono essere aggiunti a questo punto. Incubare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente.
Dopo 20 minuti, lavare le celle con un millilitro di tampone di lavaggio come mostrato in precedenza. Infine, colorare il DNA per l'analisi del ciclo cellulare. Allentare il pellet muovendo il tubo e aggiungere 20 microlitri della soluzione 7-AAD. È fondamentale utilizzare una quantità costante di 7-AAD per cella. Risospendere le cellule in un millilitro di tampone di colorazione. Successivamente, eseguire l'analisi di citometria a flusso.