Co-coltura 2D di cellule leucemiche con BMSC: un metodo per ottenere sottopopolazioni di cellule leucemiche

- In un sistema di co-coltura 2D, più tipi di cellule vengono coltivati insieme in piastre di coltura piatte. Questo sistema di coltura facilita lo studio delle interazioni cellulari e del comportamento in vitro. Per stabilire la co-coltura di cellule leucemiche con cellule stromali del midollo osseo, o BMSC, aggiungere una sospensione di cellule leucemiche a una coltura monostrato aderente di BMSC. Incubare la piastra in condizioni di coltura appropriate. Mantenere la co-coltura sostituendo il 90% del terreno di coltura ogni quattro giorni.

Durante questa co-coltura 2D, le cellule leucemiche interagiscono con le BMSC e si localizzano in regioni distinte della coltura, formando tre sottopopolazioni. La microscopia a contrasto di fase consente di differenziare visivamente le tre sottopopolazioni. Il primo gruppo di cellule leucemiche che appare liberamente fluttuante nel mezzo è classificato come cellule sospese. Il secondo gruppo di cellule leucemiche che hanno aderito alla superficie del monostrato BMSC appare luminoso e sono classificate come cellule luminose di fase.

Il terzo gruppo di cellule leucemiche che sono migrate sotto il monostrato appare debole e sono classificate come cellule a attenuazione di fase. Nel seguente protocollo, eseguiamo la co-coltura di leucemia linfoblastica acuta, o cellule LLA, con cellule stromali del midollo osseo umano.

- Iniziare seminando da 5 a 20 volte da 10 alla sesta cellula leucemica in 10 millilitri di terreno di coltura specifico per il tumore su una piastra da 100 millimetri di cellule stromali confluenti del midollo osseo o osteoblasti. Ogni quattro giorni, inclinare la piastra di lato e aspirare tutto tranne 1 millilitro del terreno, facendo attenzione a non disturbare lo strato cellulare aderente. Quindi, aggiungere con cautela 9 millilitri di terreno di coltura cellulare leucemica fresca goccia a goccia nell'angolo della piastra lungo il lato per garantire una rottura minima delle cellule aderenti.

Dopo il 12° giorno di co-coltura, pipettare delicatamente il terreno di coltura su e giù sulla piastra circa 5-10 volte per raccogliere le cellule leucemiche galleggianti e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Quindi, riseminare le cellule su una nuova piastra di cellule stromali del midollo osseo confluenti dall'80% al 90% o osteoblasti, come appena dimostrato. Entro il giorno 4, si saranno formate tre sottopopolazioni di cellule leucemiche, con le cellule leucemiche sospese che fluttuano liberamente nel mezzo, le cellule leucemiche phase-bright hanno aderito alla superficie del monostrato cellulare aderente e le cellule leucemiche phase-dim sono migrate sotto il monostrato.