Prelievo di sangue retro-orbitale: un metodo per isolare le cellule mononucleate dal seno retro-orbitale di un topo

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- Per prima cosa, tieni un topo anestetizzato per il collo e sporgi l'occhio. Inserire un sottile tubo capillare nel canto mediale dell'occhio. Lasciare che il sangue fluisca per azione capillare in un tubo. Trasferire il sangue in una provetta rivestita di EDTA e mantenerla in ghiaccio. L'EDTA lega gli ioni calcio, impedendo la coagulazione del sangue. Una temperatura più bassa riduce l'attività glicolitica delle cellule e le possibilità di contaminazione microbica.

Successivamente, diluire il sangue con un tampone contenente EDTA e mescolare bene. Aggiungere con cura uno strato di una soluzione di separazione appropriata sul fondo, senza disturbare il sangue. Centrifugare la sospensione. Il polimero nella soluzione di separazione aggrega i globuli rossi e sedimenta sul fondo. Le cellule mononucleate e le piastrine, essendo più leggere del polimero, si depositano al di sopra del gradiente polimerico.

Rimuovere lo strato superiore contenente plasma e raccogliere l'anello bianco opaco contenente le cellule mononucleate. Diluire le cellule utilizzando PBS e centrifugare per rimuovere il plasma e le piastrine residui. Utilizzare le celle mononucleate isolate per ulteriori analisi. Il seguente protocollo dimostrerà l'isolamento di cellule mononucleate da un topo congenico iniettato con una linea cellulare leucemica C1498.

- Inserire un tubo capillare nel canto mediale dell'occhio dell'animale leucemico anestetizzato. Verranno prelevati da 100 a 200 microlitri di sangue dal seno orbitale nel tubo capillare. Rimuovere il tubo e controllare l'emorragia con l'applicazione delicata di una spugna di garza sterile sull'occhio. Quindi, trasferire il sangue in una provetta EDTA e conservare la provetta in ghiaccio fino all'isolamento della cellula mononucleata.

Per isolare le cellule mononucleate del sangue, aggiungere prima PBS integrato con EDTA da 1 millimolare fino a un volume finale di 500 microlitri. Quindi, trasferire il campione in una provetta da microcentrifuga. Successivamente, utilizzare una siringa da 1 millilitro dotata di un ago calibro 30 per sovrapporre accuratamente 500 microlitri di soluzione separante sotto il sangue, facendo attenzione a non mescolare gli strati.

Separare le cellule mediante centrifugazione e utilizzare una pipetta per trasferire lo strato di cellule mononucleate bianche opache in una nuova provetta per microcentrifuga. Quindi lavare le cellule immunitarie in 1 millilitro di PBS. Centrifugarli e risospendere il pellet in 600 microlitri di tampone FACS per la colorazione e l'analisi mediante citometria a flusso.

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Ultimo aggiornamento: 1 agosto 2026