Prelievo di sangue retro-orbitale: un metodo per isolare le cellule mononucleate dal seno retro-orbitale di un topo

- Per prima cosa, tieni un topo anestetizzato per il collo e sporgi l'occhio. Inserire un sottile tubo capillare nel canto mediale dell'occhio. Lasciare che il sangue fluisca per azione capillare in un tubo. Trasferire il sangue in una provetta rivestita di EDTA e mantenerla in ghiaccio. L'EDTA lega gli ioni calcio, impedendo la coagulazione del sangue. Una temperatura più bassa riduce l'attività glicolitica delle cellule e le possibilità di contaminazione microbica.

Successivamente, diluire il sangue con un tampone contenente EDTA e mescolare bene. Aggiungere con cura uno strato di una soluzione di separazione appropriata sul fondo, senza disturbare il sangue. Centrifugare la sospensione. Il polimero nella soluzione di separazione aggrega i globuli rossi e sedimenta sul fondo. Le cellule mononucleate e le piastrine, essendo più leggere del polimero, si depositano al di sopra del gradiente polimerico.

Rimuovere lo strato superiore contenente plasma e raccogliere l'anello bianco opaco contenente le cellule mononucleate. Diluire le cellule utilizzando PBS e centrifugare per rimuovere il plasma e le piastrine residui. Utilizzare le celle mononucleate isolate per ulteriori analisi. Il