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Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 4:39 min • April 30th, 2023
- Il saggio del flusso extracellulare aiuta a studiare il metabolismo cellulare misurando le due principali vie energetiche: glicolisi e respirazione mitocondriale. Durante la glicolisi, le cellule metabolizzano il glucosio e secernono lattato nello spazio extracellulare insieme ai protoni, determinato misurando il tasso di acidificazione extracellulare o ECAR. Durante la respirazione mitocondriale, le cellule utilizzano l'ossigeno per la produzione di ATP, misurata determinando il tasso di consumo di ossigeno o OCR.
Le cellule tumorali mostrano un elevato assorbimento di glucosio poiché alterano il loro tasso metabolico per adattarsi e mantenere la proliferazione cellulare non regolata. Per analizzare il metabolismo nelle cellule tumorali, assemblare prima una micropiastra per l'analisi del flusso contenente un monostrato di cellule tumorali aderenti e una cartuccia del sensore idratata. Trasferire il gruppo piastra in un analizzatore di flusso. All'interno dell'analizzatore, le sonde del sensore scendono per creare una microcamera transitoria. Per misurare il flusso extracellulare, la porta di iniezione introduce i composti di prova nella micropiastra in punti temporali prestabiliti.
In base al metabolismo cellulare, le concentrazioni di ossigeno disponibili e i protoni rilasciati nella microcamera fluttuano. Due fluorofori incorporati alla base della cartuccia rilevano e misurano simultaneamente i livelli di ossigeno e protoni, indicativi rispettivamente della respirazione mitocondriale e della glicolisi. Nel seguente protocollo, dimostreremo un saggio di flusso extracellulare per misurare l'attività metabolica delle cellule leucemiche primarie.
- Nel frattempo, per preparare le piastre per l'analisi del flusso extracellulare, aggiungere 12,5 microlitri di soluzione adesiva cellulare in ciascun pozzetto di due piastre analizzatrici di flusso extracellulare a 8 pozzetti. Dopo 20 minuti, aspirare l'adesivo cellulare e lavare ogni pozzetto due volte con 200 microlitri di acqua sterile per lavaggio.
Dopo il secondo lavaggio, lasciare le piastre nella cappa fino a quando i pozzetti non sono asciutti e posizionare la cartuccia del sensore capovolta sul banco del laboratorio. Separare la piastra di servizio e la cartuccia del sensore dell'analizzatore di flusso e riempire ogni pozzetto della piastra di servizio con 200 microlitri di calibrante e ogni fossato intorno all'esterno dei pozzetti con 400 microlitri di calibrante.
Riposizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di servizio che ora contiene il calibratore e posizionare il gruppo cartuccia in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius senza CO2 durante la notte. Quindi accendere l'analizzatore di flusso extracellulare e lasciarlo riscaldare a 37 gradi Celsius durante la notte.
La mattina seguente, trasferire le cellule dal pallone in provette coniche da 50 millilitri per la centrifugazione e risospendere i pellet in 1 millilitro del terreno sperimentale appropriato per il conteggio. Risospendere le cellule a 4 volte 10 per le 6 cellule in 400 microlitri di concentrazione del mezzo sperimentale e aggiungere 50 microlitri di cellule nei pozzetti da B a G della piastra dell'analizzatore di flusso e 180 microlitri del mezzo sperimentale nei pozzetti A e H come pozzetti di controllo del fondo.
Dopo la centrifugazione, aggiungere lentamente e con attenzione 130 microlitri del terreno sperimentale ai pozzetti da B a G e confermare visivamente l'aderenza stabile delle cellule al fondo di ciascun pozzetto al microscopio. Quindi rimettere la piastra di analisi del flusso nell'incubatore umidificato a 37 gradi Celsius senza CO2 per 30 minuti.
20 minuti prima della fine dell'incubazione, caricare i composti nelle apposite porte iniettori della cartuccia secondo il protocollo sperimentale, come indicato in tabella. Quindi impostare il programma di analisi del flusso extracellulare appropriato. Avviare il programma e sostituire la piastra di calibrazione con la piastra di analisi quando richiesto.