DNA Stabile-isotopica Probing (DNA-SIP)

L'obiettivo generale di questa procedura è recuperare il DNA da microrganismi attivi che hanno consumato un substrato di crescita di interesse, senza la necessità di coltivazione in laboratorio. Questo risultato si ottiene innanzitutto incubando un campione ambientale con un substrato di interesse marcato con isotopi stabili, in condizioni simili a quelle presenti nell'ambiente naturale. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'estrazione del DNA totale da questo campione marcato con isotopi.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel sottoporre questo DNA a ultracentrifugazione in gradiente di densità in cloruro di cesio. L'ultimo passaggio della procedura è frazionare il gradiente di densità per ottenere DNA pesante e leggero da sottoporre a successive caratterizzazioni molecolari. Infine, è possibile ottenere risultati che rivelano l'identità di microorganismi attivi ma non coltivati coinvolti nel metabolismo di un particolare substrato attraverso una varietà di tecniche molecolari possibili, tra cui fingerprinting, microarray, ibridazione, analisi di cloni e librerie, e metagenomica.

Ciao, sono Josh Neufeld del Dipartimento di Biologia dell'Università di Waterloo. Sono Eric Dunford, studente laureato nel laboratorio di Newfeld. Oggi vi mostreremo una procedura di analisi isotopica del DNA, o DNA-SIP, che si è affermata come una tecnica ampiamente utilizzata per collegare l'identità di microorganismi sconosciuti e potenzialmente non coltivabili alla loro capacità di utilizzare un substrato di crescita di interesse.

Utilizziamo questo procedimento nel laboratorio Newfeld per studiare il metabolismo delle fonti di carbonio in una varietà di ambienti terrestri e acquatici. Oggi vi mostreremo l'applicazione di un particolare substrato di carbonio, glucosio 13C, a un campione di suolo. Tuttavia, riconosciamo che da quando questo metodo è stato sviluppato per la prima volta dal gruppo di Colin Merle presso l'Università di Warwick, i ricercatori hanno diversificato il protocollo per applicarlo a una varietà di ambienti diversi e anche utilizzando diversi isotopi marcati come azoto e ossigeno.

Oggi ci concentreremo sul carbonio, ma il protocollo stesso può essere applicato a diversi disegni sperimentali. Cominciamo dunque. Prima dell'inizio di questa procedura, preparare tutti i reagenti per il DNA stable isotope probing o per il DNA CYP come descritto nella parte scritta di questo protocollo.

DNAC inizia con l'incubazione del campione. Le condizioni di incubazione variano notevolmente a seconda di diverse caratteristiche del campione e del substrato. Una volta determinate empiricamente le condizioni di incubazione appropriate, aggiungere al campione ambientale il corretto arricchimento del substrato.

È inoltre possibile scegliere di aggiungere nutrienti supplementari per favorire la crescita microbica, qualora questi siano necessari in base alle incubazioni di prova. Una volta allestita l'incubazione del campione, chiudere ed ermeticamente sigillare il campione, quindi incubare i campioni ambientali contenenti il substrato marcato. L'esempio mostrato prevede l'aggiunta di una soluzione di glucosio marcato con carbonio 13 a un campione di suolo.

Successivamente, impostare un'incubazione di controllo da utilizzare come confronto per confermare l'etichettatura apparente dell'acido nucleico osservata nei passaggi successivi. Preparare questo campione in condizioni identiche, utilizzando però carbonio non marcato come substrato; sigillare e incubare il campione ambientale con il substrato non marcato nelle stesse condizioni. Dopo l'incubazione, estrarre il DNA dai microcosmi utilizzando un protocollo di estrazione adatto alle applicazioni successive desiderate. Quindi quantificare il DNA estratto per i successivi passaggi di ultracentrifugazione mediante elettroforesi su gel e spettrofotometro.

Utilizzare rotori verticali o quasi verticali per l'ultracentrifugazione al fine di garantire la massima separazione possibile tra il DNA leggero e quello pesante. Il rotore Beckman Coulter VTI 65.2 dispone di 16 alloggiamenti per contenere provette polimeriche sigillabili da 5,1 millilitri per la preparazione dei campioni destinati all'ultracentrifugazione. Per prima cosa, calcolare il volume di DNA estratto necessario per aggiungere da 0,5 a cinque microgrammi di DNA nelle provette per ultracentrifugazione.

Utilizzando le concentrazioni di DNA precedentemente determinate, determinare poi la densità esatta della soluzione madre di cloruro di cesio mediante un refrattometro digitale. Come indicato nel protocollo scritto, calcolare il volume di soluzione di DNA nel buffer del gradiente necessario per ottenere un rapporto di miscelazione appropriato.

Utilizzando questi calcoli, combinare il DNA estratto con il buffer a gradiente e 4,8 millilitri di cloruro di cesio in un tubo sterile monouso da 15 millilitri. Il volume risultante sarà superiore alla capacità specificata dei tubi per centrifuga, in modo da riempirli completamente. Infine, omogeneizzare la soluzione capovolgendo il tubo 10 volte, variando questo protocollo.

Utilizzare un agente di separazione come ahy e bromuro all'interno della soluzione a gradiente per consentire la visualizzazione del DNA all'interno del tubo. Modificare la densità del DNA preparato con DNA da coltura pura, inclusa una gradiente di bromuro di AUM come mostrato qui, è particolarmente utile per ottenere una conferma visiva immediata della formazione del gradiente dopo ogni centrifugazione. I passaggi da eseguire con tale approccio sono descritti nel protocollo scritto.

Per preparare l'ultracentrifugazione, utilizzare una pipetta con pallina e riempire con attenzione le provette per ultracentrifuga con le soluzioni gradienti. Etichettare le provette sul bordo superiore con un pennarello indelebile fine. Assicurarsi che le provette siano riempite esattamente fino alla base del collo, poiché provette insufficientemente riempite tendono a rompersi durante l'ultracentrifugazione.

Dopo aver riempito tutti i tubi richiesti con le soluzioni campione, registrare la massa precisa di ciascun tubo, raggruppare i tubi in coppie il più simili possibile e aggiungere o rimuovere piccole quantità di soluzione finché non risultano bilanciati entro 10 milligrammi. Mantenere il livello della soluzione il più vicino possibile alla base del tappo del tubo. Quindi sigillare i tubi utilizzando un tappo a pressione seguendo le istruzioni del produttore.

Verificare che i tubi siano sigillati correttamente capovolgendoli ed esercitando una pressione moderata. Pesare nuovamente i tubi per accertarsi che siano ancora bilanciati dopo la sigillatura, prima dell'ultracentrifugazione. Ispezionare attentamente ogni alloggiamento del rotore per assicurarsi che sia pulito e privo di polvere e detriti che potrebbero perforare i tubi durante l'ultracentrifugazione.

Inserire le provette nel rotore, posizionando le coppie bilanciate una di fronte all'altra. Registrare la posizione del rotore di ogni campione poiché il processo di ultracentrifugazione può rendere illeggibili le etichette dei marcatori. Sigillare con cura i pozzetti del rotore come indicato dal produttore.

Dopo aver sigillato le alloggiamenti del rotore, caricare il rotore nell'ultracentrifuga. Chiudere lo sportello dell'ultracentrifuga e applicare il vuoto per il rotore VTI 65.2. Impostare la velocità di rotazione a 44.100 giri al minuto, la temperatura a 20 gradi Celsius e il tempo di ultracentrifugazione da 36 a 40 ore.

Assicurarsi che il vuoto sia attivo, selezionare l'accelerazione massima e disattivare il freno per evitare che il gradiente venga alterato da una decelerazione. Immediatamente dopo l'ultracentrifugazione, rimuovere con attenzione il rotore. Fare attenzione a non inclinare o urtare il rotore per evitare di disturbare i gradienti all'interno dei tubi.

Infine, rimuovere delicatamente i tubi per la frazionatura del gradiente. Il DNA può essere estratto dai tubi dell'ultracentrifuga utilizzando la tecnica di frazionamento. Per iniziare, riempire una siringa sterile da 60 millilitri con acqua distillata e deionizzata sterile contenente un quantitativo sufficiente di colorante blu propofol.

Per ottenere un colore blu scuro, posizionare la siringa sul braccio di caricamento della pompa per siringhe. Quindi collegare il tubicino della pompa munito di un ago da 23 gauge lungo un pollice e accendere la pompa finché non esce un po' d'acqua dall'estremità dell'ago. Evitare bolle d'aria nell'alimentazione idrica poiché influirebbero negativamente sul processo di frazionamento.

Per ogni campione, preparare 12 provette sterili da microcentrifuga di 1,5 millilitro con etichette che indicano il numero del campione e la frazione. Successivamente, fissare una delle provette per ultracentrifugazione a un supporto con morsetto con un movimento rapido e controllato. Forare il fondo della provetta lungo la saldatura della provetta utilizzando un ago sterile da un pollice, calibro 23, e ruotare l'ago per assicurarsi che si formi un foro uniforme.

Potrebbe risultare che i guanti in lattice offrano una migliore presa sull'asta dell'ago rispetto ai guanti in nitrile. Utilizzando l'ago collegato al tubo della pompa, perforare la parte superiore del tubo sulla spalla superiore del tubo lungo la saldatura, in modo rapido e controllato. Si noti che è possibile anche perforare prima la parte superiore del tubo e successivamente quella inferiore.

Inoltre, si noti che una piccola quantità di olio minerale che ricopre la spalla del tubo può aiutare a prevenire perdite dovute a una sigillatura non corretta intorno all'ago superiore, anche quando la pompa è stata precedentemente calibrata. Pompare l'acqua colorata nella parte superiore del tubo per ottenere 12 frazioni da 425 microlitri in 12 minuti. Utilizzare un timer per raccogliere la soluzione del gradiente nei tubi microcentrifuga etichettati.

Infine, verificare la densità di tutte le frazioni per almeno un campione o un gradiente di controllo, utilizzando un refrattometro digitale. Ci si aspetta valori compresi tra 1,690 e 1,760 grammi per millilitro, con una densità mediana di circa 1,725 grammi per millilitro, necessaria per precipitare il DNA da tutte le frazioni.

Aggiungere innanzitutto 20 microgrammi di poli acrilamide lineare come vettore per la precipitazione e mescolare per inversione. Quindi aggiungere due volumi di soluzione di PEG e mescolare nuovamente per inversione. Lasciare i tubi a temperatura ambiente per due ore per consentire la precipitazione del DNA dopo l'incubazione.

Posizionare i campioni in una microcentrifuga con le provette orientate nella stessa direzione per garantire una localizzazione consistente del pellet. Centrifugare le provette a 13.000 G per 30 minuti; al termine della centrifugazione, rimuovere i campioni dalla microcentrifuga, quindi aspirare con attenzione e scartare il sopranatante. A questo punto, il pellet dovrebbe essere visibile con l'aiuto di una fonte luminosa intensa.

Lavare il pellet con 500 microlitri di etanolo al 70% dopo aver centrifugato il pellet. Centrifugare i campioni a 13.000 ×g per 10 minuti; dopo la centrifugazione, aspirare con attenzione e scartare il soprannatante. Il pellet sarà ora più visibile, ma si staccherà più facilmente dalla parete del tubo.

Lasciare asciugare il pellet a temperatura ambiente per 15 minuti. Una volta asciutti, sospendere ciascun pellet in 50 microlitri di tampone TE. Infine, eseguire cinque microlitri di ciascuna frazione su un gel ad aeros per caratterizzare le frazioni del gradiente utilizzando i metodi descritti nel protocollo scritto.

I risultati tipici della SIP del DNA mostreranno una separazione del DNA marcato e non marcato nella forma di gradiente ottenuta mediante ultracentrifugazione. Idealmente, si avrà una risoluzione completa del materiale genetico ad alto peso molecolare, come il carbonio 13 e l'azoto 15, rispetto al materiale non marcato, in particolare con impronte molecolari uniche basate su PCR associate alle frazioni dalla quattro all'otto di campioni incubati con isotopi stabili, ma non con il substrato nativo. I controlli incubati forniscono solide evidenze che collegano organismi specifici al metabolismo di particolari substrati marcati, quando vengono eseguiti su DNA di due colture pure: il ceppo di *Methyloccus capsulatus* marcato con carbonio 13 e *Syntrophomonas mediititerranea* ATCC 1021 non marcato; il DNA genomico marcato e non marcato si separa in frazioni di gradiente distinte con densità differenti.

In questo esempio, il DNA marcato con isotopi pesanti può essere osservato nelle frazioni da quattro a cinque, mentre il DNA non marcato si trova ad alte concentrazioni nelle frazioni da nove a dieci. Il DNA amplificato mediante PCR dalle stesse frazioni è stato analizzato mediante elettroforesi su gel denaturante e con gradiente, o DGGE, generando profili di bande distinte corrispondenti ai due organismi inclusi nel gradiente. La densità delle frazioni varia approssimativamente da 1,580 a 1,759 grammi per millilitro ed è mostrata in ordine decrescente da sinistra a destra.

Al contrario, la separazione degli isotopi e le incubazioni di campioni ambientali possono risultare più difficili da interpretare. Terreni di tundra provenienti da Resolute Bay, Canada, sono stati incubati con glucosio marcato al carbonio 12 o al carbonio 13 per un periodo di 14 giorni a 15 gradi Celsius. I gel degli aero-estratti del DNA frazionato purificato hanno rivelato uno smearing di DNA genomico compreso tra la frazione sette e la frazione dieci, sia per le incubazioni con carbonio 12 che con carbonio 13.

Tuttavia, quando l'elettroforesi in gel con gradiente denaturante (DGGE) dei geni dell'RNA ribosomiale 16S è stata utilizzata per determinare l'arricchimento in carbonio 13 della biomassa proveniente da specifici taxa microbici, il suolo incubato con glucosio carbonio 12 ha prodotto profili di DNA simili in tutte le frazioni del gradiente, mentre il campione incubato con glucosio carbonio 13 ha generato impronte DGGE unicamente associate alle frazioni da cinque a otto; le bande conservate indicate dalle frecce rappresentavano un fenotipo filogenetico dominante comune a tutte le frazioni del gradiente. Il fenotipo filogenetico si sposta verso frazioni più pesanti per il DNA ottenuto dal suolo incubato con glucosio carbonio 13. L'identità di questo particolare gene dell'RNA ribosomiale 16S può essere determinata per guidare approcci successivi basati su metagenomica o su coltura.

Abbiamo appena mostrato come eseguire un esperimento di marcatura isotopica stabile del DNA, partendo dall'incubazione dei campioni fino all'ottenimento del DNA marcato per l'analisi molecolare. Quando si esegue questa procedura, è importante prestare attenzione alla progettazione sperimentale, avendo cura di non aggiungere troppo substrato per evitare di favorire organismi a crescita rapida. È inoltre consigliabile evitare incubazioni prolungate, in modo che il substrato non si diluisca tra altri membri della comunità attraverso la rete trofica.

Quindi, è necessario utilizzare la quantità esatta di substrato e tempi di incubazione sufficienti per consentire la rilevazione di piccole quantità di DNA marcato nelle frazioni pesanti mediante applicazioni sensibili basate sulla PCR. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.