DNA Stabile-isotopica Probing (DNA-SIP)

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di recuperare il DNA da microrganismi attivi che hanno consumato un substrato di crescita di interesse senza il prerequisito della coltivazione in laboratorio. Ciò si ottiene incubando prima un campione ambientale con un substrato di interesse marcato con isotopi stabili in condizioni simili a quelle che si trovano nell'ambiente nativo. Il secondo passo della procedura consiste nell'estrarre il DNA totale da questo campione marcato con isotopi.

La terza fase della procedura consiste nel sottoporre questo DNA a ultracentrifugazione in gradiente di densità in cloruro di cesio. La fase finale della procedura consiste nel frazionare il gradiente di densità per ottenere DNA pesante e leggero per la successiva caratterizzazione molecolare. In definitiva, si possono ottenere risultati che rivelano l'identità di microrganismi attivi ancora non coltivati coinvolti nel metabolismo di un particolare substrato attraverso una varietà di possibili tecniche molecolari, tra cui il fingerprinting, il microarray, l'ibridazione, il clone, l'analisi delle librerie e la metagenomica.

Ciao, sono Josh Neufeld del Dipartimento di Biologia dell'Università di Waterloo. Sono Eric Dunford, uno studente laureato presso il Newfeld Lab. Oggi vi mostreremo una procedura per il sondaggio isotopico del DNA, o DNA sip, che è diventata una tecnica ampiamente utilizzata per collegare l'identità di microrganismi sconosciuti e potenzialmente non coltivati con la loro capacità di utilizzare un substrato di crescita di interesse.

Utilizziamo questa procedura nel laboratorio di Newfeld per studiare il metabolismo delle fonti di carbonio in una varietà di ambienti terrestri e acquatici. Oggi vi mostreremo l'applicazione di un particolare substrato di carbonio 13 C glucosio su un campione di terreno. Ma riconosciamo che da quando questo metodo è stato sviluppato per la prima volta dal gruppo di Colin Merle presso l'Università di Warwick, i ricercatori hanno diversificato il protocollo da applicare a una varietà di ambienti diversi e anche utilizzando una varietà di diversi isotopi marcati come l'azoto e l'ossigeno.

Oggi ci concentreremo sul carbonio, ma il protocollo stesso può essere applicato a diversi disegni sperimentali. Quindi iniziamo. Prima di iniziare questa procedura, preparare tutti i reagenti per il sondaggio degli isotopi stabili del DNA o il DNA CYP come descritto nella parte scritta di questo protocollo.

Il DNAC inizia con l'incubazione del campione. Le condizioni di incubazione variano notevolmente a seconda di una varietà di caratteristiche del campione e del substrato. Una volta determinate empiricamente le condizioni di incubazione appropriate, aggiungere l'ammendante del substrato appropriato al campione ambientale.

Puoi anche scegliere di includere nutrienti supplementari per consentire la crescita microbica, se questi sono necessari in base alle incubazioni dei test. Una volta impostata l'incubazione del campione, tappare e sigillare il campione, quindi incubare i campioni ambientali contenenti il substrato etichettato. L'esempio mostrato prevede l'aggiunta di una soluzione di glucosio marcata con carbonio 13 a un campione di terreno.

Successivamente, impostare un'incubazione di controllo che funga da confronto per confermare l'etichettatura apparente dell'acido nucleico osservata nelle fasi successive. Preparare questo campione in condizioni identiche, ad eccezione dell'utilizzo di carbonio non marcato come tappo del substrato, sigillare e incubare il campione ambientale con substrato non etichettato nelle stesse condizioni dopo l'estratto di incubazione del DNA dai microcosmi utilizzando un protocollo di estrazione adatto alle applicazioni a valle desiderate. Quindi quantificare il DNA estratto per le successive fasi di ultracentrifugazione utilizzando un gel aous e uno spettrofotometro.

Utilizzare rotori verticali o quasi verticali per l'ultracentrifugazione per garantire la massima separazione possibile di DNA leggero e pesante. Il rotore Beckman Coulter VTI 65.2 è dotato di 16 pozzetti per contenere provette in polimero a tenuta rapida da 5,1 millilitri per preparare i campioni per l'ultracentrifugazione. Innanzitutto, calcola il volume di DNA estratto necessario per aggiungere da 0,5 a cinque microgrammi di DNA alle provette per ultracentrifuga.

Utilizzando le concentrazioni di DNA precedentemente determinate. Quindi determinare l'esatta densità della soluzione madre di cloruro di cesio utilizzando un rifrattometro digitale. Come suggerito nel protocollo scritto, calcolare il volume della soluzione di DNA tampone a gradiente necessaria per generare un rapporto di miscelazione appropriato.

Utilizzando questi calcoli, combinare il DNA estratto con un tampone a gradiente e 4,8 millilitri di cloruro di cesio in una provetta sterile monouso da 15 millilitri. Il volume risultante sarà maggiore della capacità specificata delle provette da centrifuga per riempire completamente le provette. Infine crea la soluzione invertendo il tubo 10 volte le variazioni di questo protocollo.

Utilizzare una forza della flora come ahy e bromuro all'interno della soluzione del gradiente per consentire la visualizzazione del DNA all'interno del tubo. L'alterazione della densità del DNA quando preparato con DNA di coltura puro, incluso un gradiente di bromuro AUM come mostrato qui, è particolarmente utile per fornire un'immediata conferma visiva della formazione del gradiente dopo ogni centrifuga. I passaggi di esecuzione nell'utilizzo di tale approccio sono descritti nel protocollo scritto.

Per impostare prima l'ultracentrifugazione, utilizzare un bulbo e passare una pipetta per riempire accuratamente le provette dell'ultracentrifuga con le soluzioni a gradiente. Etichettare i tubi sulla spalla del tubo con un pennarello indelebile fine. Assicurarsi che le provette siano riempite esattamente fino alla base del collo della provetta, poiché le provette riempite in modo insufficiente tendono a scoppiare durante l'ultracentrifugazione.

Una volta che tutte le provette necessarie sono state riempite con le soluzioni campione, registrare la massa precisa di ciascuna provetta, ordinare le provette in coppie strettamente corrispondenti e aggiungere o rimuovere le nuove quantità di soluzione fino a quando non sono bilanciate entro 10 milligrammi. Mantenere il livello della soluzione il più vicino possibile alla base del tubo. Quindi sigillare i tubi utilizzando un copritubo secondo le istruzioni del produttore.

Verificare che i tubi siano sigillati correttamente capovolgendoli e applicando una pressione moderata. Pesare nuovamente le provette per verificare che siano ancora bilanciate dopo la sigillatura prima dell'ultracentrifugazione. Ispezionare attentamente ogni rotore per assicurarsi che sia pulito e privo di polvere e detriti che potrebbero perforare le provette durante l'ultracentrifugazione.

Inserire i tubi nel rotore, posizionando le coppie bilanciate l'una di fronte all'altra. Registrare la posizione del rotore di ciascun campione in quanto il processo di ultracentrifugazione può rendere leggibili le etichette dei marcatori. Sigillare accuratamente i pozzetti del rotore come indicato dal produttore.

Una volta sigillati i pozzetti del rotore, caricare il rotore nell'ultracentrifuga. Chiudere lo sportello dell'ultracentrifuga e applicare il vuoto per il rotore VTI 65.2. Impostare la velocità di rotazione a 44, 100 giri/min, la temperatura a 20 gradi Celsius e il tempo di ultracentrifugazione a 36-40 ore.

Assicurarsi che la depressione sia attiva, selezionare l'accelerazione massima e disinserire il freno per assicurarsi che la pendenza non venga interrotta dalla decelerazione. Subito dopo l'ultracentrifugazione, rimuovere con cautela il rotore. Fare attenzione a non inclinare o urtare il rotore per evitare di disturbare le pendenze all'interno dei tubi.

Infine, rimuovere delicatamente i tubi per il frazionamento in gradiente. Il DNA può essere estratto dalle provette dell'ultracentrifuga utilizzando la tecnica del frazionamento. Per iniziare, riempire una siringa sterile da 60 millilitri con acqua sterile distillata e deionizzata contenente una quantità sufficiente di colorante blu propofol.

Per ottenere un colore blu scuro, posizionare la siringa sul braccio di caricamento della pompa a siringa. Quindi collegare il tubo della pompa dotato di un ago da 23 pollici e accendere la pompa fino a quando un po' d'acqua non fuoriesce dall'estremità dell'ago. Evitare bolle d'aria nella rete idrica in quanto influenzeranno negativamente il processo di frazionamento.

Per ogni campione, preparare 12 provette sterili da microcentrifuga da 1,5 millilitri con etichette che indichino il numero e la frazione del campione. Quindi, fissare una delle provette per ultracentrifugazione a un supporto a morsetto con un movimento rapido e controllato. Forare il fondo del tubo lungo la cucitura del tubo utilizzando un ago nuovo da 23 gauge da un pollice e ruotare l'ago per assicurarsi che si sia formato un foro uniforme.

Potresti scoprire che i guanti in lattice offrono una presa migliore sull'albero dell'ago rispetto ai guanti in nitrile. Utilizzando l'ago attaccato al tubo della pompa, perforare la parte superiore del tubo sulla spalla superiore del tubo lungo la cucitura in modo rapido e controllato. Si noti che è possibile forare anche la parte superiore del tubo seguita dalla parte inferiore del tubo.

Inoltre, si noti che una piccola quantità di olio minerale che ricopre la spalla del tubo può aiutare a prevenire perdite dovute a una tenuta impropria attorno all'ago superiore con una velocità della pompa precedentemente calibrata. Pompare l'acqua colorata nella parte superiore del tubo per ottenere 12.425 frazioni di microlitri in 12 minuti. Utilizzare un timer per raccogliere la soluzione del gradiente nelle provette per microcentrifuga etichettate.

Infine, controllare la densità di tutte le frazioni per almeno un campione o un gradiente di controllo. Utilizzando un rifrattometro digitale. Aspettatevi valori compresi tra 1,690 e 1,760 grammi per millilitro con una densità mediana di circa 1,725 grammi per millilitro per far precipitare il DNA da tutte le frazioni.

Innanzitutto, aggiungere 20 microgrammi di poliacrilammide lineare come vettore per la precipitazione e mescolare per inversione. Quindi aggiungere due volumi di soluzione PEG e di nuovo, mescolare per inversione. Lasciare le provette a temperatura ambiente per due ore per consentire al DNA di precipitare dopo l'incubazione.

Ha posto i campioni in una microcentrifuga con le provette orientate nella stessa direzione per garantire una localizzazione coerente della centrifuga a pellet. Le provette a 13.000 G per 30 minuti dopo la centrifugazione hanno recuperato i campioni dalla microcentrifuga, quindi hanno aspirato con cura e scartato l'app supernat. Il pellet dovrebbe essere visibile in questa fase con l'aiuto di una fonte di luce intensa.

Lavare il pellet con 500 microlitri di etanolo al 70% dopo aver lavato la centrifuga a pellet. I campioni a 13.000 G per 10 minuti dopo la centrifugazione aspirano accuratamente e scartano il supernat. Il pellet sarà più visibile ora, ma si dissocierà più facilmente dalla parete del tubo.

Lasciare asciugare il pellet a temperatura ambiente per 15 minuti. Una volta che i pellet si sono asciugati, sospendere ogni pellet in 50 microlitri di tampone TE. Infine, eseguire cinque microlitri di ciascuna frazione su un gel aeros per caratterizzare le frazioni di gradiente utilizzando i metodi discussi nel protocollo scritto.

I risultati tipici della SIP del DNA dimostreranno una separazione del DNA marcato e non marcato in forma di gradiente mediante ultracentrifugazione. Idealmente, ci sarà una risoluzione completa del materiale genetico ad alto peso molecolare come il carbonio 13 e l'azoto 15 da materiale non marcato in particolare, impronte digitali uniche basate su PCR associate alle frazioni da quattro a otto di campioni incubati con isotopi stabili, ma non con substrato nativo. I controlli incubati forniscono una forte evidenza che collega organismi specifici con il metabolismo di un particolare substrato marcato quando eseguiti su DNA proveniente da due colture pure, il bagno di ceppo di capsulite marcato con carbonio 13 e il Sian medi A TCC 10 21 non marcato, etichettato come DNA genomico non marcato, separati in frazioni di gradiente rispettate con densità diverse.

In questo esempio, il DNA marcato con isotopi pesanti può essere osservato nelle frazioni da quattro a cinque, mentre il DNA non marcato si trova ad alte concentrazioni nelle frazioni da nove a 10. Il DNA amplificato con PCR dalle stesse frazioni è stato eseguito utilizzando l'elettroforesi su gel di denatura e gradiente o DGGE e ha generato modelli di bande discrete corrispondenti ai due organismi inclusi nel gradiente. La densità delle frazioni varia da circa 1,580 a 1,759 grammi per millilitro e sono mostrate in ordine decrescente da sinistra a destra.

Al contrario, la separazione degli isotopi e l'incubazione dei campioni ambientali possono essere più difficili da interpretare. I terreni della tundra di Resolute Bay, in Canada, sono stati incubati con carbonio 12 o carbonio 13 marcato con glucosio per un periodo di 14 giorni a 15 gradi Celsius. I gel aerodinamici del DNA purificato della frazione di gradiente hanno rivelato lo striscio di DNA genomico attraverso la frazione da sette a 10 sia per l'incubazione del carbonio 12 che per quella del carbonio 13.

Tuttavia, quando il DGGE dei geni dell'RNA ribosomiale 16 è stato utilizzato per determinare l'arricchimento di carbonio 13 della biomassa da particolari taxa microbici, il suolo incubato con glucosio carbonio-12, il DNA ha generato modelli simili in tutte le frazioni di gradiente, mentre il campione incubato con glucosio carbonio-13 ha generato impronte digitali DGG che sono associate in modo univoco con le frazioni da cinque a otto. Le bande conservate indicate dalle frecce rappresentavano il tipo di phylo dominante coerente in tutte le frazioni di gradiente. Il tipo phylo si sposta verso frazioni più pesanti per il DNA ottenuto dal suolo incubato con glucosio e carbonio 13. L'identità di questo particolare gene dell'RNA ribosomiale 16 s può essere determinata per guidare successivi approcci metagenomici o basati sulla coltivazione.

Ti abbiamo appena mostrato come eseguire un esperimento di sondaggio di isotopi stabili del DNA, dall'incubazione dei campioni all'ottenimento di DNA marcato per l'analisi molecolare. Quando si esegue questa procedura, è importante considerare attentamente il disegno sperimentale, fare attenzione a evitare di aggiungere troppo substrato per evitare di orientare l'esperimento verso organismi a crescita rapida. Si vuole anche evitare un'incubazione prolungata in modo che il substrato non si diluisca con gli altri membri di una comunità attraverso una rete alimentare.

Pertanto, è necessario utilizzare la giusta quantità di substrato e tempi di incubazione sufficienti per consentire di rilevare piccole quantità di DNA marcato in frazioni pesanti con applicazioni sensibili basate sulla PCR. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.