Name: DNA Stabile-isotopica Probing (DNA-SIP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-02T17:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: Impara il DNA-SIP per identificare microrganismi attivi senza coltivazione usando gradienti di densità in cloruro di cesio. Questo metodo rivela la funzione metabolica delle comunità microbiche ambientali.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto Strategico e borse di Discovery per JDN dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC).

<ol><li>Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-specific+clades+of+active+marine+methylotrophs+associated+with+a+phytoplankton+bloom+in+a+temperate+coastal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).</li>
<li>Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+populations+active+in+metabolism+of+C1+compounds+in+the+sediment+of+Lake+Washington%2C+a+freshwater+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).</li>
<li>Padmanabhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration+of+13C-labelled+substrates+added+to+soil+in+the+field+and+subsequent+16S+rRNA+gene+analysis+of+13C-labelled+soil+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).</li>
<li>Bernard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+identification+of+soil+microbial+populations+actively+assimilating+carbon+from+13C-labelled+wheat+residue+as+estimated+by+DNA-+and+RNA-SIP+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques.</a> Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).</li>
<li>Haichar, elZ. ahar, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cellulolytic+bacteria+in+soil+by+stable+isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing.</a> Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).</li>
<li>Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing%3A+Technical+considerations+when+resolving+15N-labelled+RNA+in+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients.</a> J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).</li>
<li>Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -F., Nelson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+with+15N+achieved+by+disentangling+the+effects+of+genome+G+%2B+C+content+and+isotope+enrichment+on+DNA+density%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).</li>
<li>Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+growing+microorganisms+in+soil+by+stable+isotope+probing+with+H218O%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+the+use+of+stable+isotope+probing+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology.</a> Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).</li>
<li>Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+SYBR+safe+technique+for+the+sensitive+detection+of+DNA+in+cesium+chloride+density+gradients+for+stable+isotope+probing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays.</a> J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).</li>
<li>Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+contamination+of+glycogen+used+in+nucleic+acid+precipitation+and+assessment+of+linear+polyacrylamide+as+an+alternative+co-precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant.</a> Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+uncultivated+majority%3A+combining+DNA+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomic+analyses+of+uncultivated+Methylocystis+in+acidic+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands.</a> Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).</li>
<li>Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+methylotrophs+revealed+by+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics.</a> Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).</li>
<li>Kalyuzhnaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+metagenomics+targets+specific+functional+types+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).</li>
<li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Something+from+%28almost%29+nothing%3A+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2, 233-241 (2008).</li>
<li>Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+SJ+%22Microbiology+of+Hydrocarbon+and+Lipid+Microbiology%22">Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology</a>. Timmis, K. N. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 4137-4158 (2010).</li>
<li>Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+eats+what%2C+where+and+when%3F+Isotope-labelling+experiments+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age.</a> ISME J. 1, 103-110 (2007).</li>
<li>Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shortens+the+incubation+time+needed+to+detect+benzoate-utilizing+denitrifying+bacteria+by+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 Forthcoming.</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Corretta progettazione di stabili-isotopo esperimenti sondaggio è di importanza critica per l&#39;ottenimento di DNA marcato al di sopra della comunità sfondo senza etichetta. Considerazioni relative a tempi di incubazione del campione, le concentrazioni di substrato, condizioni di incubazione (per esempio nutrienti, umidità del suolo), alimentazione incrociata e la replicazione sono stati discussi altrove 10,18 e si raccomanda al lettore di consultare le pubblicazioni quando si progetta un incubazione SIP. R...

<table><tbody><tr><td>Bromofenolo blu</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP115-25</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di cesio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP210-500</td><td></td></tr><tr><td>Etilene alcol, grado reagente</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>652261</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>351285212</td><td></td></tr><tr><td>Poliacrilamide lineare</td><td>Reagente</td><td>Applichem</td><td>A6587</td><td></td></tr><tr><td>Polietilene glicole 6000</td><td>Reagente</td><td>VWR international</td><td>CAPX1286L-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42409-0010</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2711</td><td></td></tr><tr><td>Granuli di idrossido di sodio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3181</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader</td><td>Attrezzatura</td><td>Clare Chemical</td><td>DR46B</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Attrezzatura</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Attrezzatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>361013650</td><td></td></tr><tr><td>Pompa per infusione</td><td>Attrezzatura</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>N/A</td><td>Numero modello: BSP&lt;br/&gt;Consultare &lt;a href=&quot;http://www.braintreesci.com">www.braintreesci.com&lt;/a&gt; per i dettagli sull'ordine.</td></tr><tr><td>Sigillatore per tubi</td><td>Attrezzatura</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>358312</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Attrezzatura</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotore per ultracentrifuga</td><td>Attrezzatura</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362754</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente di luce ultravioletta</td><td>Attrezzatura</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0017-09</td><td>Qualsiasi sorgente UV è adeguata</td></tr><tr><td>Schermo facciale per luce ultravioletta</td><td>Attrezzatura</td><td>Fisher Scientific</td><td>114051C</td><td></td></tr><tr><td>Tappi in gomma butilica, grigi</td><td>Materiale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27232</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per centrifuga</td><td>Materiale</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>342412</td><td></td></tr><tr><td>Ago ipodermico, calibro 23, lunghezza 2&amp;#8221;</td><td>Materiale</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Tubi microfuga, 1,5 mL</td><td>Materiale</td><td>DiaMed</td><td>AD151-N500</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizioni centrali aperte, diametro 20 mm</td><td>Materiale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27230-U</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di Pasteur, in vetro</td><td>Materiale</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6C</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipetta</td><td>Materiale</td><td>DiaMed</td><td>BPS340-1000</td><td>Il numero di catalogo si riferisce a punte da 200 &amp;#x03BC;l. Punte da 10 o 20 &amp;#x03BC;l possono essere acquistate dalla stessa fonte</td></tr><tr><td>Tubazione per pompa, diametro interno 1,5 mm x spessore parete 1,5 mm</td><td>Materiale</td><td>Appleton Woods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi con tappo a vite, 15 mL</td><td>Materiale</td><td>DiaMed</td><td>AD15MLP-S</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi per siero, volume 125 mL</td><td>Materiale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114014</td><td></td></tr><tr><td>Siringa, 60 mL</td><td>Materiale</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr></tbody></table>

dna stabile-isotopica probing (dna-sip)

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA-isotopo stabile sondaggio (DNA-SIP) è una tecnica potente per identificare i microrganismi attivi che assimilare particolari substrati di carbonio e di sostanze nutritive in biomassa cellulare. Come tale, questa coltura-indipendente tecnica è stata una metodologia per l&#39;assegnazione di importanti funzioni metaboliche per le diverse comunità che abitano una vasta gamma di ambienti terrestri e acquatici. Dopo l&#39;incubazione di un campione ambientale con isotopi stabili-molecole marcate, estratto acido nucleico è sottoposto a ultracentrifugazione gradiente di densità e di frazionamento gradiente successive per separare gli acidi nucleici di quote differenziate. Purificazione del DNA da cloruro di cesio recupera etichettati e privi di etichetta del DNA per la successiva caratterizzazione molecolare (ad esempio le impronte digitali, microarray, biblioteche clone, metagenomica). Questo protocollo video JOVE fornisce visive passo-passo le spiegazioni del protocollo per il frazionamento gradiente ultracentrifugazione gradiente di densità, e il recupero del DNA marcato. Il protocollo include anche i dati del campione SIP ed evidenzia importanti suggerimenti e precauzioni che devono essere considerati per assicurare il successo del DNA-SIP analisi.

DNA-isotopo stabile sondaggio è un metodo di coltivazione-indipendente di identificare e caratterizzare le comunità di microrganismi attivi che sono in grado di utilizzare substrati specifici. L&#39;assimilazione del substrato arricchito in isotopo pesante porta alla costituzione degli atomi indicati sull&#39;etichetta in biomassa microbica. Ultracentrifugazione gradiente di densità recupera DNA etichettato per la valle analisi molecolari.

DNA Stabile-isotopica Probing (DNA-SIP)

Il DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) è una tecnica potente per identificare i microrganismi attivi che assimilano particolari substrati di carbonio e...

L'obiettivo generale di questa procedura è recuperare il DNA da microrganismi attivi che hanno consumato un substrato di crescita di interesse, senza la necessità di coltivazione in laboratorio. Questo risultato si ottiene innanzitutto incubando un campione ambientale con un substrato di interesse marcato con isotopi stabili, in condizioni simili a quelle presenti nell'ambiente naturale. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'estrazione del DNA totale da questo campione marcato con isotopi.Il terzo passaggio della procedura consiste nel sottoporre questo DNA a ultracentrifugazione in gradiente di densità in cloruro di cesio. L'ultimo passaggio della procedura è frazionare il gradiente di densità per ottenere DNA pesante e leggero da sottoporre a successive caratterizzazioni molecolari. Infine, è possibile ottenere risultati che rivelano l'identità di microorganismi attivi ma non coltivati coinvolti nel metabolismo di un particolare substrato attraverso una varietà di tecniche molecolari possibili, tra cui fingerprinting, microarray, ibridazione, analisi di cloni e librerie, e metagenomica.Ciao, sono Josh Neufeld del Dipartimento di Biologia dell'Università di Waterloo.

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