Saggio di immunoprecipitazione della cromatina: una tecnica per studiare le interazioni proteina-DNA nelle cellule

- L'immunoprecipitazione della cromatina, o ChIP, è una tecnica utilizzata per determinare le interazioni proteina-DNA nelle cellule. Le proteine si legano a siti specifici sul DNA e regolano l'espressione genica. Innanzitutto, stabilizzare il complesso DNA-proteina con formaldeide. La formaldeide lega le proteine alla sequenza di DNA associata formando legami covalenti.

Successivamente, utilizzare un tampone di lisi adatto per lisare le cellule per rilasciare la cromatina contenente i complessi DNA-proteina reticolati. Centrifugare la sospensione e sonicare il surnatante per ottenere frammenti di cromatina. Successivamente, etichettare il campione con un anticorpo adatto che si lega specificamente alla proteina legata al DNA.

Aggiungere perline magnetiche specializzate al campione. La perlina riconosce l'anticorpo e si lega ad esso. Usa un magnete per raccogliere le perle magnetiche con il complesso anticorpo-proteina-DNA. Lavare il campione per rimuovere la cromatina non legata o gli anticorpi. Aggiungere un tampone ad alta concentrazione di sale al complesso e incubare a temperature più elevate per invertire i legami incrociati delle proteine del DNA.

Utilizzando un magnete, raccogliere il surnatante contenente il DNA e le proteine. Aggiungere l'enzima proteinasi K per degradare le proteine nel campione. Aggiungere un tampone adatto per precipitare il DNA e utilizzarlo per ulteriori analisi. Il seguente protocollo dimostrerà l'immunoprecipitazione della cromatina nelle cellule di leucemia linfatica cronica per identificare i geni bersaglio di NFAT2.

- Per prima cosa, preparare 20 microlitri di perle rivestite di proteina A per ogni precipitazione in una provetta da 1,5 millilitri. Lasciare riposare le perline su una griglia magnetica per un minuto e rimuovere il surnatante. Quindi lavare le perle con 40 microlitri di 1x tampone ChIP 1 per ogni 20 microlitri di perle rivestite di proteina A pipettando su e giù.

Lasciare riposare le perline su una griglia magnetica per un minuto e rimuovere il surnatante. Ripetere questo processo di lavaggio altre tre volte prima di risospendere le perle nel loro volume originale di 1x buffer ChIP 1. Aggiungere BSA, inibitore della proteasi, tampone ChIP 5x e acqua di grado ChIP-seq alle perline. Quindi, aggiungi la cromatina tranciata.

Utilizzare 10 microgrammi di anticorpi anti-NFAT2 per catturare NFAT2 e 2,5 microgrammi di anticorpi IgG come controllo. Incubare le miscele per una notte a 4 gradi Celsius su una ruota che gira a sei giri/min. Il giorno successivo, centrifugare le provette per cinque secondi a 7.000 volte g e incubarle sulla rastrelliera magnetica per un minuto.

Quindi, aspirare il surnatante e lavare le perle una volta con i tamponi di lavaggio 1, 2, 3 e 4, consecutivamente. Centrifugare le provette per cinque secondi a 7.000 volte g prima di incubare le provette sul rack magnetico per un minuto. Successivamente, rimuovere il surnatante e aggiungere il tampone di lavaggio successivo.

Dopo l'ultimo lavaggio, centrifugare le provette per cinque secondi a 7.000 volte g. Incubare le provette sul rack magnetico per un minuto. Rimuovere il surnatante e raccogliere le perle in 100 microlitri di tampone di eluizione 1. Quindi, incubare i tubi sulla ruota rotante per 30 minuti.

Quindi, far girare brevemente le provette e posizionarle su una griglia magnetica per un minuto. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri e aggiungere 4 microlitri di tampone di eluizione 2. Per creare il controllo di ingresso, mescolare 1 microlitro della cromatina tranciata con 99 microlitri di tampone di eluizione uno e 4 microlitri di tampone di eluizione due. Quindi incubare i campioni per quattro ore a 65 gradi Celsius con agitazione.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di isopropanolo al 100% ai tubi. Agitare e far girare i campioni per cinque secondi a 7.000 volte g. Quindi aggiungere 10 microlitri di perline magnetiche a ciascun campione. Agitare e incubare i campioni su una ruota rotante a temperatura ambiente per un'ora.

Quindi, far girare brevemente le provette e posizionarle su una griglia magnetica per un minuto. Aspirare il surnatante e risospendere le perle in 100 microlitri di tampone di lavaggio. Capovolgere le provette per mescolarle e incubarle per cinque minuti su una ruota rotante a temperatura ambiente. Quindi centrifugare brevemente le provette. Metterli in una griglia magnetica per un minuto e utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio due. Capovolgere le provette per mescolarle e incubarle per cinque minuti su una ruota rotante a temperatura ambiente. Dopodiché, centrifugare brevemente le provette e metterle in una griglia magnetica per un minuto. Rimuovere il tampone di lavaggio due, tramite aspirazione, e risospendere le perle in 55 microlitri di tampone di eluizione.

Per eluire il DNA precipitato, incubare i campioni in una ruota rotante a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopodiché, girare brevemente le provette e metterle in una rastrelliera magnetica per un minuto. Infine, trasferire il surnatante in nuove provette da 1,5 millilitri.