Coltura e raccolta di cloni di HSPC: un metodo per ottenere i cloni di HSPC selezionati singolarmente

- Cellule staminali e progenitrici ematopoietiche o HSPC, possono autorinnovarsi e differenziarsi in vari tipi di cellule del sangue. Le HSPC accumulano gradualmente mutazioni del DNA nel corso della vita, il che può contribuire alla leucemia. Per analizzare tali mutazioni, le HSPC vengono generate solitamente dal midollo osseo.

Inizia aggiungendo anticorpi coniugati con fluorofori alle cellule mononucleate - cellule staminali adulte isolate dal midollo osseo - e incubandole per la durata desiderata. Gli anticorpi si legano a specifici marcatori della superficie cellulare come il CD34. Ora, caricare la miscela nella citometria cellulare attivata dalla fluorescenza o nella macchina FACS.

Gli anticorpi coniugati con fluorofori emettono fluorescenza quando vengono colpiti dal laser. Le singole goccioline cellulari passano attraverso il rivelatore che misura l'intensità della fluorescenza, in base alla quale la goccia possiede una carica elettrica. In presenza di campi elettromagnetici, le celle caricate positivamente si spostano verso il contenitore negativo e viceversa.

Ora, coltivate gli HSPC CD34-positivi ordinati FACS in un terreno appropriato per la durata desiderata fino a quando i cloni non sono visibili. Quindi, rimuovere i cloni mediante pipettaggio vigoroso e centrifugare per pellettare le cellule. Conservare il pellet contenente HSPC clonali a meno 20 gradi Celsius per ulteriori analisi. Nel seguente protocollo, genereremo cloni di HSPC dalle celle mononucleate.

- Iniziare questa procedura con la preparazione del materiale campione e la colorazione come descritto nel protocollo di testo. Quindi, preparare 25 millilitri di terreno di coltura per cellule staminali e progenitrici ematopoietiche, o HSPC. Riempire una piastra di coltura cellulare da 384 pozzetti con 75 microlitri di terreno di coltura HSPC in ciascun pozzetto. Per evitare l'evaporazione del terreno nei pozzetti esterni, riempire i pozzetti esterni con 75 microlitri di acqua sterile o PBS e non utilizzare questi pozzetti per la selezione cellulare.

Il corretto smistamento degli HSPC a segnale vitale è il passaggio più critico di questo protocollo. Impostare i cancelli per lo smistamento HSPC in base a un controllo non colorato in 10.000 cellule dal campione di colorazione. Gate singole celle disegnando un gate attorno all'altezza di dispersione diretta lineare rispetto alla frazione dell'area di dispersione in avanti.

Utilizzare la frazione di controllo non colorata per disegnare un cancello per la frazione di lignaggio. Disegna i gate per le cellule CD34 positive e caratterizza ulteriormente questo sottoinsieme impostando un gate specifico per le cellule CD38 negative e CD45RA negative. Caricare la piastra a 384 pozzetti sulla macchina FACS e smistare le singole cellule. Se applicabile alla macchina FACS, attivare l'opzione per mantenere i dati di ordinamento dell'indice per abilitare il ritracciamento delle celle ordinate.

Per coltivare HSC singolarmente, avvolgere la piastra di coltura a 384 pozzetti con coperchio in un involucro di polietilene trasparente. Trasferire la piastra a 384 pozzetti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e tenerla nell'incubatore per tre o quattro settimane fino alla comparsa di cloni visibili. Dopo quattro settimane di coltivazione, determina quali pozzetti hanno una confluenza del 30% o superiore.

Per ogni clone, preriempire microprovette da 1,5 millimetri con 1 millilitro di BSA all'1% in PBS ed etichettare la provetta in base al pozzetto corrispondente. Pre-bagnare il puntale di una pipetta con l'1% di BSA in PBS per ridurre al minimo il numero di cellule che si attaccano al puntale della pipetta. Pipettare ferocemente il terreno su e giù almeno cinque volte mentre si raschia il fondo del pozzetto con una pipetta da 200 microlitri impostata a 75 microlitri.

Raccogliere la sospensione cellulare nella microprovetta etichettata che corrisponde al pozzetto. Ripetere il pipettaggio nel pozzetto con un massimo di 75 microlitri di BSA e PBS freschi all'1% per garantire il massimo assorbimento delle cellule. Le cellule coltivate clonalmente possono attaccarsi al fondo di un pozzetto. Ispezionare i pozzetti utilizzando un microscopio a luce inversa standard per assicurarsi che tutte le cellule siano state raccolte.

Se tutti i pozzetti con confluenza superiore al 30% sono stati raccolti, riposizionare la piastra da 384 pozzetti nell'incubatore. Le colture clonali possono proliferare fino a cinque settimane. Far girare la sospensione cellulare per cinque minuti a 350 volte g. Dovrebbe essere visibile un piccolo pellet. Rimuovere con cura tutti i microlitri di surnatante tranne circa cinque. I pellet cellulari possono essere congelati a meno 20 gradi Celsius e conservati per diversi mesi prima dell'isolamento del DNA.