Smistamento cellulare attivato magneticamente: un metodo per isolare le cellule positive C-KIT

- c-Kit, o CD117, è un recettore transmembrana tirosin-chinasico espresso da cellule staminali ematopoietiche o progenitrici presenti nel midollo osseo e nel sangue. È anche un marcatore per rilevare la leucemia mieloide acuta.

Per isolare le cellule c-Kit positive, raccogliere le ossa murine delle zampe e schiacciarle per rilasciare il midollo dall'interno. Filtrare la sospensione midollare per rimuovere eventuali frammenti ossei. Stratificare il filtrato contenente cellule del midollo osseo su un mezzo a gradiente di densità e centrifugare per separare le cellule mononucleate dalle altre frazioni.

Raccogliere lo strato torbido di cellule mononucleate in una provetta contenente microsfere coniugate ad anticorpi di topo anti-CD117. Incubare per i complessi anticorpo-perlina per legarsi ai recettori CD117 sulle cellule c-Kit positive. Far passare la sospensione incubata attraverso una colonna magnetica posta in un campo magnetico. Tutte le celle positive c-Kit marcate con le microsfere magnetiche rimangono nella colonna, mentre le celle non marcate vi passano attraverso.

Rimuovere la colonna dal campo magnetico e lavare il contenuto utilizzando un tampone adatto per eluire le celle positive c-Kit. Nel seguente protocollo, mostreremo l'isolamento di cellule c-Kit positive dal midollo osseo di un topo transgenico.

- Per iniziare, raccogli le ossa delle zampe da un topo soppresso. Pulisci i tessuti dalle ossa con un bisturi. Quindi, metti le ossa in PBS freddo sul ghiaccio e schiaccia le ossa con un pestello. Successivamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in una provetta con tappo a vite da 50 millilitri con una pipetta da 10 millilitri. Lavare il mortaio e il pestello più volte con PBS freddo e aggiungere la sospensione cellulare al tubo da 50 millilitri.

Successivamente, centrifugare il midollo osseo e rimuovere il surnatante con il vuoto e la pipetta di vetro. Risospendere il pellet di cella in cinque millilitri di PBS. Usando una pipetta, aggiungere lentamente il midollo osseo sospeso alla parte superiore del polisaccarosio a temperatura ambiente.

Successivamente, centrifugare il polisaccarosio a 400 g per 20 minuti con il freno spento. Dopo la cetrifugazione, raccogliere l'interfaccia torbida della cella mononucleata totale con una pipetta e trasferirla in una nuova provetta da 15 millilitri. Portare il volume a 10 millilitri con PBS e rimuovere 20 microlitri per il conteggio.

Dopo la cetrifugazione, scartare il surnatante e mettere il pellet sul ghiaccio. Quindi, risospendere il pellet della cella in PBS con EDTA e BSA. Aggiungere le microsfere CD117 alla sospensione cellulare e vortice per mescolare. Successivamente, incubare la sospensione per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Quindi, portare il volume fino a 10 millilitri con più PBS con EDTA e BSA e centrifugare a 1.200 G a 4 gradi Celsius per cinque minuti.

Utilizzare il vuoto per rimuovere il surnatante e sospendere il pellet di cella in PBS con EDTA e BSA. Quindi, aggiungere tre millilitri di PBS con EDTA e BSA a un supporto magnetico con una colonna magnetica e lasciarlo fluire in una provetta di raccolta. Dopo che il tampone ha terminato di fluire attraverso la colonna, aggiungere la sospensione cellulare e lasciarla fluire attraverso la colonna nella provetta di raccolta.

Quindi, aggiungere altri 5 millilitri di PBS con EDTA e BSA alla colonna e sciacquarla immediatamente con lo stantuffo. Rimuovere lo stantuffo e ripetere il risciacquo prima di contare le cellule. Dopo aver centrifugato le cellule, rimuovere il surnatante e sospendere il pellet cellulare in IMDM completo per la coltura. Coltivare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.