Trasduzione retrovirale-mediata: un metodo per introdurre il gene bersaglio nelle cellule tumorali

- I retrovirus sono virus a RNA che si replicano utilizzando la trascrittasi inversa per convertire il loro genoma a RNA in DNA a doppio filamento e integrarsi in modo permanente nel genoma dell'ospite. Nuove particelle virali escono dalla cellula e possono infettare altre cellule. La terapia genica del cancro impiega vettori retrovirali per introdurre geni terapeutici nelle cellule bersaglio attraverso una tecnica chiamata trasduzione per sottoregolare il gene mutato o eliminare le cellule.

Per ottenere vettori retrovirali ad alto titolo, trasfettare le cellule HEK 293 con una miscela di trasfezione contenente il plasmide retrovirale desiderato, il plasmide di confezionamento e un agente di trasfezione adatto. Incubare le cellule. L'agente trasfettante facilita la consegna di entrambi i plasmidi nelle cellule.

Il plasmide retrovirale codifica il genoma virale con il gene bersaglio, mentre il plasmide di imballaggio codifica le proteine dell'involucro virale. Il macchinario cellulare delle cellule di imballaggio forma particelle retrovirali e le rilascia nel mezzo. Raccogliere il surnatante virale e centrifugare per rimuovere le cellule.

Trasferire la concentrazione desiderata di particelle virali e cellule tumorali su una piastra di coltura rivestita di fibronectina per facilitare il legame delle proteine dell'involucro virale alle cellule. Incubare le cellule. Raccogliere le cellule ed eseguire la citometria a flusso per analizzare l'efficienza di trasduzione. Questo protocollo eseguirà la trasduzione mediata retrovirale di cellule di midollo osseo di topo c-Kit-positive.

- Per prima cosa, combina il DNA del plasmide retrovirale con il plasmide di imballaggio, il cloruro di calcio e l'acqua in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere 500 microlitri di HBS a un altro tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia al tubo contenente HBS mescolando contemporaneamente con il vortice impostato sull'impostazione più bassa.

Incubare la miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Durante il periodo di incubazione, aggiungere clorochina alle cellule HEK e tenerle nell'incubatore. Dopo aver aggiunto la miscela di trasfezione, incubare le cellule per 8 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2, cambiando il terreno cellulare aggiungendo 14 millilitri di terreno DMEM 10 fresco molto lentamente. Il pipettaggio lento contro la parete della piastra aiuta a prevenire lo stripping delle cellule HEK.

Quindi incubare le cellule per una notte nell'incubatore a 37 gradi Celsius, 5% di CO2. Utilizzare una siringa da 10 millilitri per raccogliere il surnatante virale. Quindi collegare un filtro per siringa da 0,45 micrometri alla siringa. Immergere il surnatante virale in un nuovo tubo di raccolta. Raccogliere il surnatante virale circa 16 ore dopo.

Successivamente, aggiungere 2 millilitri di frammento di fibronectina umana ricombinante in PBS a piastre di coltura a 6 pozzetti non trattate. Il giorno successivo, utilizzare una pipetta per rimuovere la fibronectina dalle piastre. Bloccare le piastre con il 2% di BSA in PBS e incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti.

Utilizzare un aspirapolvere per rimuovere BSA e lavare le piastre con PBS prima di rimuoverlo con l'aspirapolvere. Successivamente, aggiungere immediatamente il surnatante virale filtrato e centrifugare la piastra per due ore. Utilizzare un aspirapolvere per rimuovere il surnatante e girare nuovamente la piastra.

Successivamente, rimuovere il surnatante con un aspirapolvere e lavare i pozzetti rivestiti di virus con PBS. Rimuovere il PBS con l'aspirapolvere. Aggiungere le cellule di topo c-Kit+ precedentemente coltivate ai pozzetti rivestiti viralmente. Dopo la centrifugazione, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. 48 ore dopo la trasduzione, pellettare le cellule mediante centrifugazione e risospenderle nel tampone FACS numero 1.