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Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 3:31 min • April 30th, 2023
- A volte, una cellula staminale o progenitrice subisce mutazioni, dando origine a una cellula staminale leucemica. In queste cellule, alcune proteine sono sovraregolate e l'uso di composti antitumorali contro tali proteine può aiutare a controllare la crescita delle cellule. L'effetto di questi composti antitumorali può essere analizzato utilizzando il saggio CFU monitorando il numero e le dimensioni delle colonie formate.
Inizia prelevando cellule progenitrici da un topo leuceme e diluendole in un terreno di coltura adatto. Aggiungere questa sospensione cellulare insieme al composto antitumorale appropriato alla metilcellulosa contenente citochine specifiche per topi e versarla in una capsula di Petri. Incubare questa miscela fino a quando non compaiono le colonie. La metilcellulosa è una matrice semisolida chimicamente inerte che impedisce la migrazione cellulare, mentre le citochine stimolano le cellule progenitrici a differenziarsi e formare colonie contenenti progenie riconoscibili.
Successivamente, colorare le colonie usando il cloruro di iodonitrotetrazolio, o INT, e incubare per una notte fino a quando le colonie diventano marrone rossastro scuro. Gli enzimi mitocondriali riducono l'INT di colore giallo a colorante formazan di colore bruno-rossastro. Infine, identificare e contare le colonie presenti sulla piastra. Nel seguente protocollo, eseguiremo un test CFU per testare l'effetto di composti antitumorali su cellule YFP-positive.
- Innanzitutto, scongelare la metilcellulosa con citochine per topi a temperatura ambiente. Quindi aliquotare 3 millilitri di metilcellulosa in una provetta FACS. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare con gli inibitori appropriati a 3 millilitri di metilcellulosa. Quindi agitare la sospensione in alto per 10-30 secondi.
Dopo che la maggior parte delle bolle d'aria è fuoriuscita, utilizzare una siringa da 1 millilitro per placcare 1 millilitro di terreno in tre piastre replicate. Metti i piatti in una grande capsula di Petri insieme a un piatto aperto contenente acqua sterile. Quindi coprire la grande capsula di Petri e incubare le cellule a 37 gradi Celsius.
Preparare la colorazione di cloruro di iodonitrotetrazolio sciogliendo 10 milligrammi di cloruro di iodonitrotetrazolio in 10 millilitri di acqua. Filtro: sterilizzare la soluzione colorante con una siringa Luer-Lok dotata di un filtro da 0,2 micrometri.
Nella cappa di coltura tissutale, aggiungere 100 microlitri di soluzione colorante goccia a goccia attorno alla piastra CFU. Quindi incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari. Infine, dopo che le colonie hanno assunto un colore rosso-marrone scuro, utilizzare uno sfondo bianco nella cappa di coltura dei tessuti sterili per scattare foto della piastra CFU colorata.