Selezione immunomagnetica negativa: un metodo per purificare le cellule B dalle cellule mononucleate del sangue periferico

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Le cellule mononucleate del sangue periferico o PBMC includono cellule B, cellule T, cellule natural killer o NK e monociti. Le cellule B producono molecole di immunoglobuline per combattere le infezioni. Nella leucemia, queste cellule si moltiplicano e metastatizzano in diversi organi.

Per isolare le cellule B, iniziare con una sospensione di PBMC isolate. Aggiungere una miscela di anticorpi primari diretta contro specifiche molecole di superficie cellulare chiamate cluster di differenziazione o CD. Gli anticorpi specifici si legano alla molecola CD-3 sulle cellule T, alla molecola CD-14 sui monociti e alla molecola CD-16 sulle cellule NK, lasciando le cellule B non marcate.

Quindi, lavare il campione per rimuovere gli anticorpi non legati. Aggiungere al campione microsfere magnetiche secondarie coniugate con anticorpi. Gli anticorpi secondari si legano alla regione FC degli anticorpi primari attaccati a cellule specifiche. Posizionare il tubo contenente la sospensione cellulare marcata sotto l'influenza di un campo magnetico. Nel campo, le cellule marcate magneticamente migrano e si legano alla parete del tubo, portando alla selezione negativa delle cellule indesiderate. Raccogliere il surnatante contenente cellule B arricchite in una nuova provetta di raccolta.

In questo protocollo, eseguiremo una selezione immunomagnetica negativa di cellule B leucemiche da PBMC di pazienti con leucemia linfatica cronica.

Scartare il surnatante e risospendere 10 milioni di PBMC in un millilitro di tampone di isolamento, che è PBS con BSA allo 0,1% e EDTA da 2 millimolari, con il pH regolato a 7,4. I linfociti della LLC devono ora essere purificati dai preparati PBMC. Quindi, aggiungere 10 microgrammi di anticorpi primari monoclonali di topo anti-CD-3, CD-14 e CD-16 e incubare per 30 minuti a 4 gradi Celsius.

Dopo aver lavato le celle con il tampone di isolamento e centrifugato a 500 volte g per 5 minuti a 4 gradi Celsius, risospendere i 10 milioni di PBMC in 1 millilitro di tampone di isolamento. Incubare le cellule risospese con 100 microlitri di perle magnetiche lavate per 30 minuti a 4 gradi Celsius con una risospensione delicata. Quindi, posizionare la provetta nel supporto magnetico per due minuti e trasferire il surnatante con le cellule non legate in una nuova provetta con una pipetta da 5 millilitri. Dopo questo passaggio, i linfociti della LLC purificati sono pronti per essere utilizzati.

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Last updated: 25 July 2026