Microdissezione dei tessuti oculari Zebrafish embrionali

Questo video mostra la microdissezione della retina e della retina con pigmento retinico, epitelio o RPE, attaccato da embrioni di zebrafish da uno a tre giorni dopo la fecondazione. Tutte le procedure possono essere eseguite con pinzette fini e materiali di laboratorio comuni. Sotto microscopi stereoscopici standard per la dissezione della retina, lo strato singolo di RPE viene rimosso e staccato mediante un'azione di spazzolamento e l'adesione del RPE alla superficie della piastra di coltura.

Per la dissezione della retina con epitelio pigmentato retinico (RPE) aderente, le proprietà adesive della piastra di coltura vengono eliminate mediante schiacciamento embrionale e lavaggio prima della dissezione. Per preservare intatto l'RPE, un sollevamento accurato di questo tessuto separa in modo efficiente coroide e sclera dalla retina con RPE aderente, seguito dalla rimozione del cristallino mediante un ago di tungsteno inciso chimicamente. Questo metodo di dissezione permette di ottenere tessuti retinici integri ed è stato utilizzato con successo per lo studio dell'espressione di RNA specifico per tessuto e dei profili della retina e dell'epitelio pigmentato retinico del pesce zebra.

Ciao, sono Li Jang del laboratorio del Professor UFE Leon del Dipartimento di Scienze Biologiche della Purdue University. Oggi vi mostreremo come dissezionare i tessuti oculari embrionali del pesce zebra. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la rete genica che regola lo sviluppo dell'occhio.

Iniziamo. Otto. Prima della microdissezione, preparare le seguenti soluzioni: e tre, soluzione di ringer sterilizzata mediante filtrazione e idrossido di sodio normale al cinque.

Successivamente, incidi chimicamente gli aghi di tungsteno. Posiziona un piccolo becher in una capsula di Petri utilizzando dell'argilla per facilitare la manipolazione del becher e prevenire il versamento dell'idrossido di sodio. Fissa una graffetta standard al lato del becher.

Versare cinque idrossidi di sodio normali nel becher finché la graffetta non entra in contatto con l'idrossido di sodio. Collegare l'elettrodo negativo di un'alimentazione in corrente continua alla graffetta e l'elettrodo positivo a un'estremità di un breve pezzo di filo di tungsteno. Avvolgere l'altra estremità del filo di tungsteno con una pallina di argilla dal diametro di quattro millimetri e immergere questa estremità nella soluzione di idrossido di sodio.

Aumentare la tensione a circa tre volt e immergere il filo su e giù a intervalli di un secondo nella soluzione di idrossido di sodio per circa 10 minuti. Il filo di tungsteno esposto all'idrossido di sodio diventerà gradualmente più sottile; quando la pallina di argilla cade dall'altro lato del filo collegato all'elettrodo positivo, avrà una forma affusolata simile a un ago. Sciacquare l'ago affilato con soluzione di Ringer o E tre per rimuovere i depositi salini e fissare l'ago a un applicatore di legno con del nastro adesivo o un porta-ago per facilitarne la manipolazione. Preparare gli embrioni per la dissezione.

Mantenere i pesci adulti super in base ai protocolli standard la notte precedente l'accoppiamento. Separare i pesci genitori in coppie in vasche statiche per l'accoppiamento utilizzando un divisorio. Rimuovere il divisorio dopo l'accensione della luce della stanza la mattina successiva e permettere ai genitori di accoppiarsi a intervalli di 10 minuti ogni mezz'ora, separando i pesci dopo ogni accoppiamento.

Mantenere gli embrioni raccolti da ciascun incrocio in modo separato in mezzo E tre a 28 gradi Celsius. Stadiare gli embrioni a 10-12 ore dalla fecondazione e rivalutare immediatamente lo stadio appena prima della dissezione nei punti temporali specifici. Utilizzare piastre di coltura in polistirene Falcon da 60 per 15 millimetri per la dissezione.

Una nuova piastra non utilizzata presenta una proprietà adesiva intrinseca per il tessuto dell'epitelio pigmentato della retina (RPE) fino a circa 20 minuti e può facilitare la rimozione dell'RPE durante le dissezioni retiniche. Se si desidera una retina con RPE aderente, tale proprietà adesiva può essere neutralizzata frantumando completamente due embrioni in una piastra di coltura contenente soluzione di Ringer, lasciandoli a riposo per 30 minuti prima della dissezione, seguiti da un ampio lavaggio con soluzione di Ringer fresca prima della dissezione. Tutte le dissezioni fini vengono eseguite con un ingrandimento compreso tra cinque e otto volte su un microscopio Olympus SC X 16 con un obiettivo da una volta.

Utilizzando pinzette di Dumont o un ago di tungsteno inciso chimicamente, si riscalda il piatto del microscopio a 28 gradi Celsius. Per minimizzare l'influenza delle fluttuazioni di temperatura all'inizio della dissezione retinica, trasferire un embrione a uno stadio di sviluppo specifico in cinque millilitri di soluzione di Ringer in una piastra di coltura Falcon da 60 per 15 millimetri preparata come descritto per la dissezione retinica senza RRPE, recidere la testa e una parte del tronco anteriore utilizzando rapidamente la punta affilata delle pinzette per rimuovere il corpo del pesce zebra. Successivamente, fissare l'estremità posteriore della sezione testa-tronco su una piastra di coltura. Con le pinzette ausiliarie, aprire la testa sul lato dorsale a partire dalla fronte anteriore.

Rimuovere il cervello in modo che il lato mediale degli occhi sia esposto e rivolto verso l'alto per ulteriori manipolazioni. Per dissezionare la retina, utilizzare la punta della pinzetta per spazzolare delicatamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) esposto sul lato mediale dell'occhio rivolto verso l'alto, fino a quando non si osserva una piccola apertura nella retina. Continuare l'azione di spazzolamento e distacco fino a quando quasi tutto il lato mediale della retina non è esposto.

Evitare di graffiare o forare la retina esposta durante la rimozione dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) laterale sulla retina dell'occhio rivolto verso il basso rispetto alla piastra di coltura. Mantenere un angolo di circa 45 gradi rispetto alla superficie della piastra e spazzolare l'occhio con la pinzetta. Rimuovere l'RPE che è relativamente ben aderente alla ora serrata fissando la porzione staccata dell'RPE alla piastra di coltura per la dissezione.

Quindi sollevare delicatamente la retina per rimuovere il RPE residuo ed eliminare il cristallino sfruttando la proprietà adesiva della piastra di coltura. Prestare attenzione a non danneggiare le cellule retiniche, che aderiranno anch'esse leggermente alla superficie della piastra. Se il cristallino non si stacca con il movimento rotatorio, utilizzare un ago di tungsteno inciso con un movimento circolare sulla superficie del cristallino.

Per iniziare la dissezione della retina con epitelio pigmentato della retina (RPE) aderente, utilizzare una piastra per colture Falcon da 60 a 15 millimetri preparata come descritto per la dissezione della retina con RPE aderente. Trasferire un embrione a uno stadio di sviluppo specifico in cinque millilitri di soluzione di Ringer. Rimuovere la testa e una parte del tronco anteriore.

Rimozione rapida del corpo del pesce zebra come eseguita in precedenza. Fissare l'estremità posteriore della sezione cefalotoracica su una piastra di coltura. Con le pinzette ausiliarie, aprire il cranio sul lato dorsale partendo dalla fronte anteriore.

Rimuovere il cervello in modo che il lato mediale degli occhi sia esposto e rivolto verso l'alto. Per ulteriori manipolazioni con pinzette, sollevare delicatamente l'occhio dal lato lateroposteriore e arrotolarlo verso il lato anteriore. La coroide e il tessuto sclerale all'esterno dello strato di epitelio pigmentato retinico (RPE) sono relativamente saldamente aderenti alla pelle e possono essere in gran parte rimossi arrotolando con attenzione l'occhio verso il lato anteriore.

Rimuovere il cristallino con l'ago di tungsteno dopo che il lato laterale dell'occhio è stato esposto e quando l'occhio è ancora attaccato alla pelle per la dissezione della retina. Senza epitelio pigmentato della retina (RPE) e con la retina a cui è attaccato l'RPE, i campioni dissecati possono essere raccolti in triolo in una microtubo per RNA per analisi successive. Caratterizzazione dell'RNA.

Qui è mostrata un'esausta dissezione della retina senza epitelio pigmentato retinico (RPE), in cui l'integrità retinica è mantenuta, come indicato dalla superficie retinica intatta. La sezione istologica corrispondente mostra inoltre che l'architettura retinica è molto ben preservata. In particolare, la conservazione della matrice extracellulare tra lo strato dei fotorecettori e l'RPE è eccezionalmente buona.

Un'accurata dissezione della retina con epitelio pigmentato della retina (RPE) aderente è indicata da uno strato di RPE integro e continuo. La sezione istologica corrispondente mostra che sia le cellule retiniche che quelle dell'RPE sono in buone condizioni. L'RNA totale estratto dalle retine dissecate è di alta qualità.

Questo è indicato dall'elettroferogramma e dall'immagine del gel ottenuti dall'analisi con il bioanalizzatore. La linea di base è piatta e i picchi ribosomiali 18 s e 28 s sono integri. Il numero di integrità dell'RNA è tipicamente superiore a 9,8.

Abbiamo appena illustrato le procedure di microdissezione per ottenere la retina di embrione di pesce zebra con e senza epitelio pigmentato retinico (RPE). Durante questa procedura, è importante ricordare che i passaggi più critici nella dissezione della retina sono l'azione di spazzolamento effettuata con la punta delle pinzette e l'arrotolamento del tessuto. Per la rimozione dei residui di RPE, abbiamo scoperto che appoggiare i gomiti sui braccioli regolabili della sedia durante la dissezione può stabilizzare in modo significativo i movimenti della mano.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.