Innesto di isole pancreatiche: un metodo per impiantare le isole pancreatiche nella camera anteriore dell'occhio del topo per l'imaging in vivo

- Le isole pancreatiche contengono cellule beta che secernono insulina. Nei pazienti con diabete di tipo 1, le cellule beta che producono insulina diventano disfunzionali. Il trapianto di isole in tali pazienti offre il potenziale per fornire il controllo glicemico. Per valutare l'efficienza del trapianto, utilizziamo modelli animali come un topo la cui camera oculare anteriore è un sito ottimale per l'innesto e l'imaging in vivo.

Per il trapianto di isole, posizionare un topo anestetizzato su un termoforo caldo e iniettare buprenorfina, un analgesico per alleviare il dolore, per via sottocutanea nella parte posteriore del topo. Successivamente, inserire il naso del topo in una maschera nasale per un apporto continuo di ossigeno e isoflurano anestetico.

Fissa la testa del mouse nel supporto per la testa per esporre l'occhio e ritrai delicatamente la palpebra usando una pinza smussata per estrarre l'occhio. Caricare una cannula con isole marcate in modo fluorescente. Inserire la mezza punta della cannula nella cornea. Sollevare la cornea, erogare delicatamente le isole, rimuovere la cannula e applicare il gel oculare.

Trascorso il periodo di tempo desiderato, posizionare il mouse sotto un microscopio a due fotoni e scattare le immagini. È possibile osservare vasi sanguigni che formano una rete microvascolare in tutto l'innesto. Nel seguente protocollo, eseguiremo l'innesto di isole pancreatiche umane nella camera oculare anteriore del topo.

Per iniziare, posiziona il mouse su un termoforo caldo, posizionalo nel supporto per la testa e indossa la maschera per il naso. Usa il pollice e l'indice per sollevare leggermente la testa. Fissalo con i pezzi metallici sui lati, assicurandoti che gli auricolari fissino la testa direttamente sotto le orecchie. Per via sottocutanea, iniettare la soluzione di buprenorfina nella parte posteriore del topo. Ritrarre delicatamente le palpebre dell'occhio da trapiantare utilizzando una pinza smussata. Estrai l'occhio e fissalo senza stringere con un paio di pinzette coperte da un tubo di polietilene.

Dopo aver trasferito le isole in una capsula di Petri con PBS, raccogliere circa 20-30 isole nella cannula oculare. Utilizzando un ago calibro 25, smussare verso l'alto, inserire con cautela la punta nella cornea e praticare un'unica incisione laterale. Sollevare con cautela la cornea con la cannula precaricata con le isole e rilasciare lentamente le isole nell'occhio. Ritrarre lentamente la cannula e applicare il gel oculare sull'occhio.

Dopo 10 minuti, rimuovere la pinza che tiene la palpebra e riportare l'occhio nella sua posizione normale. Per l'imaging di isole umane impiantate con microscopia a due fotoni, posizionare la piattaforma del supporto della testa sotto il microscopio e somministrare il gel oculare sull'occhio come liquido di immersione tra la cornea e la lente. Posizionare l'occhio sotto l'obiettivo e visualizzare le isole umane impiantate come descritto nel manoscritto del testo.