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0 visualizzazioni • 5:11 min • April 30th, 2023
- Gli organoidi sono minuscole colture cellulari tridimensionali derivate da cellule staminali tessuto-specifiche. Sono genomicamente stabili ma geneticamente modificabili attraverso la trasfezione e quindi ideali per l'indagine genetica. Per la trasfezione, seminare gli organoidi in una piastra di coltura multipozzetto con un terreno di coltura specifico e incubare per la durata desiderata. Quindi, aggiungi una miscela di dissociazione alla piastra per aiutare la dissociazione delle cellule organoidi. Trasferire il composto in una provetta e centrifugare. Risospendere il pellet dell'organoide in un tampone di elettroporazione contenente DNA plasmidico marcato in fluorescenza. Il tampone stabilizza le cellule e previene la morte cellulare dovuta allo stress elettrico.
Trasferire la miscela in una cuvetta ed elettroporare le cellule. Gli impulsi elettrici attraverso la membrana cellulare provocano la formazione temporanea di pori per facilitare l'assorbimento del DNA plasmidico nella cellula. Dopo l'elettroporazione, aggiungere immediatamente il terreno di coltura alla sospensione cellulare e trasferire la miscela in una provetta. Ora, centrifugare le cellule. Risospendere il pellet nella matrice basamentale e trasferirlo alla piastra multipozzetto per la polimerizzazione. Posizionare la piastra sotto un microscopio a fluorescenza e verificare la fluorescenza nelle cellule, che conferma l'efficienza della trasfezione. Nel seguente protocollo, eseguiremo l'elettroporazione per trasfettare gli organoidi gastrointestinali.
- Iniziare preriscaldando piastre a 48 pozzetti a 37 gradi Celsius per la semina post-elettroporazione, quindi preparare terreni basali e organoidi specifici per coltura secondo le indicazioni del manoscritto. Coltivare cinque pozzetti di organoidi per campione di elettroporazione in una piastra a 48 pozzetti. Preparare 230 microlitri di reagente di dissociazione con 10 micromolari Y27632 per pozzetto. Monitorare gli organoidi al microscopio. Rimuovere il terreno di coltura dai pozzetti e dissociare meccanicamente gli organoidi nella miscela di dissociazione preparata. Raggruppare cinque pozzetti per campione di elettroporazione in una provetta da 15 millilitri.
Mescolare il contenuto della provetta mediante vortice e incubarla per 5-15 minuti a 37 gradi Celsius fino a quando non si formano gruppi di 10-15 cellule, controllando la dissociazione con il microscopio. Fermare la digestione aggiungendo fino a 10 millilitri di terreno basale senza antibiotici. Centrifugare la provetta a 450 volte g per cinque minuti. Scartare il surnatante e lavare le celle due volte con 4 millilitri di tampone di elettroporazione. Centrifugare ed eliminare il surnatante dopo ogni lavaggio. Dopo i lavaggi, risospendere il pellet organoide in 100 microlitri di tampone di elettroporazione con 30 microgrammi di DNA plasmidico.
Erogare l'intera miscela DNA-organoide in una cuvetta per elettroporazione. Assicurati di evitare bolle d'aria. Impostare i parametri di elettroporazione come descritto nel manoscritto di testo e picchiettare la cuvetta con un dito per mescolare delicatamente le cellule. Posizionare la cuvetta nella camera della cuvetta e premere il pulsante di impedenza sull'elettroporatore per prendere nota del valore di impedenza. Premere il pulsante Start per avviare il programma di elettroporazione e controllare i valori delle correnti, delle tensioni e delle energie visualizzate.
Dopo l'elettroporazione, aggiungere immediatamente 500 microlitri di terreno di coltura senza antibiotici alle cellule e mescolare pipettando su e giù. Trasferire il campione in una nuova provetta da 15 millilitri e sciacquare la cuvetta con terreno basale per raccogliere le cellule rimanenti, quindi incubare le cellule a temperatura ambiente per 40 minuti. Centrifugare le cellule a 450 volte g per cinque minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 100 microlitri di matrice basamentale e seminare 20 gocce da microlitro in una piastra preriscaldata a 48 pozzetti.
Incubare la piastra per 10 minuti a 37 gradi Celsius per la polimerizzazione e aggiungere 250 microlitri di terreno di coltura integrato con Y27632 e CHIR-99021 per pozzetto. Per determinare l'efficienza della trasfezione, controllare la fluorescenza nel controllo della trasfezione al microscopio dopo 24-48 ore.