Imaging della dinamica del calcio nelle cellule pancreatiche: una tecnica per studiare i cambiamenti in tempo reale nella concentrazione citosolica di calcio nelle isole pancreatiche

- Le isole pancreatiche sono un gruppo di cellule pancreatiche produttrici di ormoni che svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi del glucosio. Un'elevata concentrazione di glucosio innesca la chiusura dei canali ionici del potassio, prevenendo l'efflusso di ioni potassio, portando alla depolarizzazione della membrana. Di conseguenza, i canali degli ioni calcio voltaggio-dipendenti si aprono, consentendo l'afflusso di ioni calcio. Questo aumento della concentrazione citosolica di calcio stimola il rilascio di ormoni come l'insulina. In tempo reale, per visualizzare la dinamica citosolica del calcio, trasferire alcune isole caricate con un colorante indicatore di calcio adatto tra le pareti distanziatrici di una rete fine preassemblata.

Posizionare la rete capovolta su un vetrino coprioggetti posizionato all'interno della camera di imaging di un microscopio invertito. Posiziona una maglia grossolana e un peso per immobilizzare le cellule. Aggiungere la soluzione di imaging nella camera. Successivamente, imposta un sistema di perfusione per introdurre il glucosio o un ormone di test di interesse. All'interno delle cellule, gli indicatori fluorescenti di calcio precaricati segnalano qualsiasi aumento delle concentrazioni di calcio citosolico. Dopo il legame con gli ioni calcio, le molecole indicatrici mostrano un aumento sostanziale dell'emissione di fluorescenza. Nel seguente protocollo, mostreremo l'imaging in tempo reale della dinamica del calcio nelle isole pancreatiche murine in risposta alla perfusione di glucosio.

- Per immobilizzare le isole per l'imaging, assemblare una camera di imaging per un microscopio invertito e posizionare un vetrino coprioggetti di vetro all'interno della camera. Assicurarsi che l'interfaccia della camera di vetro sia a tenuta stagna e verificare che il vetrino coprioggetti sia a portata di mano dell'obiettivo del microscopio. Quindi, taglia quadrati da 20 X 20 millimetri di maglia fine e grossa e usa pezzi da 45 a 50 micrometri di nastro adesivo spesso per creare due pareti distanziatrici su un pezzo di maglia fine. Immergere la maglia grossolana e un peso in una piastra di Petri da 35 millimetri di soluzione di imaging e posizionare la maglia fine sotto un microscopio da dissezione.

Capovolgere la maglia fine con le pareti del distanziatore capovolte e i distanziatori rivolti verso l'alto e utilizzare una pipetta P20 per trasferire diverse isole tra i due distanziatori. Utilizzando una pinza da orologiaio, posizionare la rete capovolta all'interno della camera di imaging del microscopio invertito in modo che i distanziatori siano rivolti verso il basso per sedersi direttamente sul vetrino coprioggetti, intrappolando le isole tra i distanziatori e la rete al centro del vetrino coprioggetti.

- Fare attenzione che la rete sia ben idratata senza contenere volumi eccessivi di soluzione, che provocherebbero il movimento laterale del campione.

- Quindi, posizionare la maglia grossa e il peso sopra la maglia fine nella camera e aggiungere la soluzione di imaging alla camera. Una volta immobilizzate le isole, selezionare la modalità di imaging e l'obiettivo sul microscopio invertito e posizionare la camera con le isole sul tavolino a temperatura controllata del microscopio. Dopo aver impostato la perifusione, posizionare l'afflusso più in basso del deflusso all'interno della camera e impostare il flusso in uscita in modo che sia maggiore del flusso in entrata.

Assicurarsi che il deflusso sia a contatto minimo con la soluzione in modo da rimuovere la soluzione in più piccole goccioline sequenziali di attesa di lunghi intervalli di rimozione continua della soluzione. Successivamente, avviare la perifusione con una soluzione di imaging contenente 3 millimolari di glucosio e selezionare il percorso della luce e i filtri per l'imaging dei fluorofori verdi. Quindi, eseguire l'imaging in tempo reale per impostare i parametri di imaging e regolare la vista per acquisire le isole di interesse.

Per ottimizzare il rapporto segnale/rumore dell'immagine, regolare l'intensità della luce di eccitazione, il tempo di esposizione e il binning, assicurandosi che le impostazioni consentano una visualizzazione distinta di ciascuna cella all'interno delle isole con la minima intensità ed esposizione della luce possibile. Quindi, fotografare le isole a una velocità compresa tra 0,1 e 5 Hertz, verificando la qualità dei dati acquisiti man mano che vengono acquisiti.