Colorazione immunofluorescente di sferoidi: una tecnica per analizzare gli sferoidi per l'espressione dell'espressione intra ed extracellulare dell'antigene

- Gli sferoidi sono modelli tridimensionali in vitro di coltura cellulare. Per la colorazione con immunofluorescenza, in primo luogo, generare una coltura sferoidale del tipo di cellula richiesto in una piastra multipozzetto. Utilizzando una micropipetta con punta a orifizio largo, raccogliere gli sferoidi, facendo attenzione ad evitare rotture dovute a forze di taglio.

Successivamente, fissare e permeabilizzare gli sferoidi per rendere permeabili le singole cellule. Ora, incubare con una soluzione contenente proteine per bloccare i siti di interazione proteica non specifici sulla superficie cellulare. Trattare gli sferoidi con un cocktail di anticorpi primari desiderato. Incubare per far sì che gli anticorpi si leghino alle molecole bersaglio sulla superficie cellulare.

Successivamente, etichettare gli sferoidi con una soluzione di anticorpi secondari marcata in fluorescenza specifica per gli anticorpi primari. Infine, trattare gli sferoidi con un colorante fluorescente adatto che lega il DNA per colorare i nuclei delle cellule. Utilizzando un microscopio a fluorescenza a scansione laser, è possibile visualizzare più sezioni ottiche dello sferoide su diversi piani ottici.

Le immagini catturate riflettono nuclei marcati in fluorescenza e antigeni di interesse. Unisci le pile utilizzando il software pertinente per ottenere l'immagine composita finale dello sferoide 3D. Nel seguente protocollo, eseguiremo la colorazione immunofluorescente di sferoidi di fibroblasti pancreatici e fibroblasti associati al cancro coltivati in presenza di uno stimolante, TGF beta 1.

- Per prima cosa, tagliare l'estremità di un puntale di pipetta per allargare l'orifizio. Al termine dell'incubazione, utilizzare questa punta di pipetta tagliata per raccogliere gli sferoidi in una provetta di reazione da 1,5 millilitri, per condizione sperimentale o per proteina da analizzare. Centrifugare gli sferoidi a 1.000 volte g per circa 30-60 secondi. Rimuovere con cautela il surnatante contenente metilcellulosa mediante pipettaggio, assicurandosi di non disturbare gli sferoidi pellettati.

- Prestare particolare attenzione durante il trasferimento degli sferoidi nei tubi di reazione. Assicurati di non avere forze di sollecitazione di taglio tagliando la punta. È anche importante raccogliere tutti gli sferoidi. Durante la fase di lavaggio, assicurarsi di non perdere gli sferoidi per aspirazione.

- Per lavare gli sferoidi a 50 microlitri di PBS 1X, centrifugare a 1.000 volte g per 30-60 secondi, quindi rimuovere con cura il PBS mediante pipettaggio. A seconda della proteina da colorare, fissare gli sferoidi con 50 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente.

Lavare gli sferoidi con PBS come descritto in precedenza. Permeabilizzare le cellule con Triton X allo 0,1% in PBS per 4 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare gli sferoidi in PBS tre volte, come descritto in precedenza. Aggiungere PBS contenente il 5% di FBS e il 2% di BSA agli sferoidi e incubare a temperatura ambiente per un'ora per bloccare i siti di interazione proteica non specifici.

Ora, incubare gli sferoidi con 30 microlitri di anticorpi primari in PBS con il 2,5% di FBS e l'1% di BSA a 4 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare gli sferoidi in PBS tre volte come descritto in precedenza.

Successivamente, incubare gli sferoidi con 30 microlitri di anticorpi secondari in PBS con FBS al 2,5% e BSA all'1% a temperatura ambiente per 90 minuti. Lavare gli sferoidi in PBS tre volte come descritto in precedenza.

Successivamente, incubare le cellule con 30 microlitri di soluzione colorante DAPI per 4 minuti a temperatura ambiente. Lavare gli sferoidi in PBS una volta come descritto in precedenza. Utilizzando una pipetta di vetro Pasteur, posizionare gli sferoidi su un vetrino in una goccia di PBS. Utilizzare un microscopio a scansione laser per visualizzare gli sferoidi mediante microscopia a fluorescenza con un ingrandimento di 10 volte. Prendi diverse sezioni ottiche dello sferoide su diversi piani ottici di uno Z-stack.