Co-colture di sferoidi 3D biostampate magneticamente: un metodo per la co-coltura di cellule cancerose e fibroblasti

- Nelle co-colture 3D biostampate magnetiche, più tipi di cellule formano strutture 3D o sferoidi sotto l'influenza dei campi magnetici. Per impostare la coltura, in primo luogo, preparare sospensioni unicellulari di cellule tumorali e fibroblasti nel loro terreno appropriato. Quindi, aggiungi nanoparticelle magnetiche biocompatibili a entrambe le sospensioni. Questi nanomateriali contengono residui di poli-L-lisina caricati positivamente che facilitano il legame aspecifico delle particelle magnetiche alla membrana cellulare attraverso interazioni elettrostatiche.

Incubare per ottenere la massima magnetizzazione delle cellule tumorali e dei fibroblasti. Successivamente, mescolare entrambe le sospensioni cellulari nel rapporto desiderato. Trasferire questa sospensione di nanoparticelle cellulari su una piastra di coltura repellente per cellule, specificamente ottimizzata per prevenire l'adesione delle cellule. Monta questa configurazione su un'unità magnetica e incuba. Le forze magnetiche guidano l'aggregazione o la biostampa di cellule tumorali magnetizzate e fibroblasti in strutture sferoidi 3D sul fondo del pozzetto.

Una volta che gli sferoidi si sono formati, rimuovete il magnete e lasciate che le co-colture 3D crescano fino al volume desiderato. In questo protocollo, dimostreremo la generazione di sferoidi di co-coltura tridimensionale da cellule tumorali pancreatiche e cellule di fibroblasti pancreatici attivate da PS1 utilizzando la tecnica del bioprinting magnetico.

Utilizzando la tecnica standard di coltura tissutale asettica, coltivare le cellule tumorali e i fibroblasti di interesse in fiasche T75 nel terreno di crescita appropriato. Quando le cellule raggiungono la confluenza dal 70% all'80%, lavare le colture una volta in 5 millilitri di PBS e staccare le cellule dalle superfici del pallone con 2 millilitri di tripsina-EDTA allo 0,05% per pallone per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo aver confermato il distacco al microscopio, disattivare la tripsina con 8 millilitri di terreno di crescita per pallone. E pipettare le cellule un paio di volte per generare sospensioni di singole cellule per il conteggio. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere i pellet in concentrazioni da 1 x 10 a un sesto di cellule per millilitro in terreno di crescita fresco.

Per magnetizzare le cellule, aggiungere 10 microlitri di NanoShuttle nel terreno di crescita per 100 microlitri di cellule e agitare delicatamente le soluzioni. Capovolgere delicatamente le provette alcune volte e trasferire le miscele cell-NanoShuttle nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Incubare le cellule a temperatura ambiente per due ore agitando delicatamente per facilitare il legame del NanoShuttle alla superficie cellulare. Al termine dell'incubazione del legame, mescolare delicatamente ciascuna sospensione cellulare magnetizzata con il pipettaggio e regolare la concentrazione a 1,5 volte 10 per le quarte cellule tumorali magnetizzate o fibroblasti per 150 microlitri di terreno.

Mescolare i fibroblasti e le cellule tumorali in un rapporto 2 a 1 per un totale di 150 microlitri di cellule seminate per pozzetto. Posizionare la piastra a 96 pozzetti repellente per le cellule sopra un'unità sferoidale magnetica a 96 pozzetti con magneti più sottili e seminare 150 microlitri di miscela cellulare in ciascun pozzetto. Quando tutte le cellule sono state piastre, incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 con l'unità sferoidale magnetica ancora attaccata. La mattina successiva, rimuovere l'unità magnetica e rimettere le cellule nell'incubatrice per un massimo di altri sette giorni.