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Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 5:39 min • April 30th, 2023
- Le cellule tumorali del pancreas interagiscono con i fibroblasti associati al cancro nel microambiente tumorale o TME. Queste interazioni modulano l'attività metabolica delle cellule tumorali e influenzano la progressione del cancro.
Gli sferoidi sono gli aggregati cellulari che ricapitolano il TME in vitro. Pertanto, possiamo utilizzare questi sferoidi per testare i cambiamenti nelle funzioni metaboliche del tumore mediante saggio del flusso extracellulare. Questo test misura la concentrazione extracellulare di ossigeno e protoni per determinare rispettivamente il metabolismo aerobico e glicolitico.
Inizia assumendo sferoidi 3D di dimensioni adeguate realizzati co-coltivando cellule tumorali pancreatiche con fibroblasti pancreatici. Ora, trasferisci gli sferoidi in una piastra di analisi del flusso e coprila con una cartuccia del sensore contenente i farmaci in esame. Eseguire il test in un analizzatore di flusso extracellulare.
L'analizzatore di flusso inietta pneumaticamente i farmaci in esame dalla cartuccia del sensore alla piastra di analisi in momenti specifici. In risposta ai farmaci in esame, le cellule rilasciano protoni e ossigeno nella microcamera della piastra e i fluorofori presenti nella sonda del sensore misurano questi livelli. Infine, utilizzando un software appropriato, analizzare la funzionalità degli sferoidi.
Nel seguente protocollo, dimostreremo un metodo per misurare la funzione metabolica delle cellule tumorali pancreatiche presenti negli sferoidi 3D utilizzando il saggio del flusso extracellulare.
Il giorno prima del test metabolico, idratare la cartuccia della sonda con 200 microlitri di calibrante per pozzetto nella piastra di utilità fornita e incubare la piastra di servizio per una notte in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius senza CO2
.La mattina successiva, osservare gli sferoidi nella cartilagine di crescita al microscopio ottico per verificarne la morfologia e l'uniformità complessiva. Trasferire la piastra di crescita su un dispositivo magnetico e aspirare con cura circa 120 microlitri di terreno di coltura per pozzetto.
Lavare delicatamente gli sferoidi con 120 microlitri di terreno di coltura riscaldato per tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, ispezionare nuovamente gli sferoidi al microscopio per confermare che gli sferoidi non siano stati lavati via e aggiungere 180 microlitri di terreno di prova caldo a ciascun pozzetto.
Utilizzare una punta larga per aspirare con cura un singolo sferoide prelavato dalla piastra di crescita repellente per cellule e trasferire delicatamente lo sferoide direttamente al centro di un pozzetto di una piastra di saggio sferoide, consentendo allo sferoide di cadere nella microcamera centrale del pozzetto per gravità.
Quando tutti gli sferoidi sono stati trasferiti, posizionare la piastra di analisi nell'incubatore ad aria umidificata a 37 gradi Celsius senza CO2 per un'ora. Durante l'incubazione, orientare la cartuccia del sensore in modo che le file da A a H si trovino sul lato sinistro e posizionare una guida di caricamento sulla parte superiore della cartuccia in modo che la lettera corrispondente alla porta da caricare si trovi nell'angolo in alto a sinistra.
Se la lastra è stata caricata in modo uniforme, aprire il software di analisi e fare clic su Modelli. Fare doppio clic su Modello vuoto e fare clic su Genera gruppi. Nella scheda Mappa piastre, assegnare gruppi alla piastra di analisi corrispondente al progetto sperimentale e selezionare i quattro pozzetti d'angolo come pozzetti di sfondo.
Nella scheda Protocollo strumento, selezionare Calibra, Equilibra e Ciclo di misurazioni di base. Fare clic su Iniezioni e definire il composto per ciascuna porta. Modificare i cicli di misurazione a 6. Rivedere il riepilogo del protocollo e del gruppo, quindi salvare il modello di progettazione del saggio.
Sulla base del design del test come guida, utilizzare una pipetta multicanale per erogare ciascun reagente direttamente nelle porte di iniezione, tenendo le guide di caricamento in posizione con la punta delle dita. Quando tutti i reagenti sono stati caricati, rimuovere la guida di caricamento e tenere la cartuccia all'altezza degli occhi per ispezionare visivamente le porte di iniezione per verificare che il caricamento sia uniforme.
Trasferire la cartuccia e la piastra di servizio all'analizzatore di flusso extracellulare e avviare la calibrazione pre-saggio. Una volta calibrata, sostituire la piastra di servizio con la piastra di analisi preriscaldata contenente gli sferoidi 3D e iniziare il saggio. Al termine del test, esportare i dati nel software di analisi dei dati appropriato.