Modello murino ortotopico fluorescente: impianto di cellule tumorali che esprimono GFP nel topo per valutare la progressione del tumore in vivo

- Le cellule tumorali che esprimono la proteina fluorescente verde o GFP consentono di monitorare la crescita e le metastasi del tumore mediante imaging ottico non invasivo. Di solito impiantamo queste cellule in un modello ortotopico, che consente la ricreazione del microambiente tumorale e imita l'interazione delle cellule tumorali con l'ambiente circostante.

Inizia posizionando un mouse anestetizzato su un termoforo caldo. Ora, inserisci il naso in una maschera nasale per fornire ossigeno e isoflurano, un anestetico. Usando una forbice, fai una piccola incisione e taglia il tessuto. Estrarre delicatamente la milza insieme al pancreas e individuare la coda pancreatica.

Caricare una siringa con una sospensione fluorescente di cellule tumorali e iniettarla delicatamente nella coda pancreatica. Una bolla superficiale appare nel sito di iniezione confermando l'avvenuto impianto. Riposizionare gli organi nella cavità del corpo e utilizzare una sutura sterile per chiudere l'incisione. Ora, rimetti il mouse in una gabbia e monitoralo fino al recupero.

Trascorso il periodo di tempo desiderato, posizionare il mouse in una camera di imaging e scattare le immagini. Il raggio di luce colpisce le cellule tumorali ed eccita la GFP, che, a sua volta, produce una fluorescenza verde. Nel seguente protocollo, eseguiremo l'impianto chirurgico di cellule tumorali pancreatiche che esprimono GFP in un modello murino ortotopico.

Per impiantare le cellule, per prima cosa, applicare un unguento sugli occhi di un topo anestetizzato e posizionare l'animale su un termoforo coperto da un telo sterile. Quindi, disinfettare delicatamente il fianco dell'animale con tre scrub allo iodio seguiti da tre risciacqui con etanolo al 70%. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, caricare circa 200 microlitri delle cellule preparate in una siringa TB da 1 millilitro pre-raffreddata dotata di un ago calibro 18.

Sostituire l'ago calibro 18 con un ago calibro 27 e riposizionare le cellule sul ghiaccio. Quindi, individua l'area generale della milza nel quadrante superiore sinistro dell'addome. Usando una pinza, pizzica la pelle sopra la milza e fai un'incisione di circa 1 centimetro per creare una tasca. Quindi, pizzica il muscolo liscio sopra la milza e taglia il tessuto per accedere alla cavità peritoneale.

Quindi, afferra delicatamente l'estremità caudale della milza ed estraila dalla cavità del corpo. Usando un batuffolo di cotone sterile umido, allargare il pancreas attaccato all'estremità della milza per localizzare la coda pancreatica. Erogare 50 microlitri di cellule nella coda pancreatica. Quindi, ruota lentamente l'ago fuori dal pancreas.

Un impianto riuscito apparirà come una bolla superficiale senza perdite. Rimetti gli organi nella cavità peritoneale e racchiudi il tutto con il muscolo e la pelle. Quindi, utilizzare una sutura 6-0 per chiudere l'incisione. Successivamente, iniettare agli animali ketoprofene e monitorarli fino a quando non si sono completamente ripresi. Al momento sperimentale appropriato, utilizzare un sistema di immagini commerciale di piccoli animali per visualizzare la crescita del tumore nell'animale vivo sotto anestesia e selezionare i filtri di eccitazione ed emissione appropriati.

Quindi, ottenere un'immagine iniziale utilizzando solo la luce bianca. Mantenendo l'animale nella stessa posizione, passare ai filtri GFP e acquisire una seconda immagine. Per analizzare la crescita del tumore, sovrapporre le immagini bianche e fluorescenti per valutare l'area fluorescente e l'intensità delle cellule tumorali.