JoVE Encyclopedia of Experiments
Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 3:14 min • April 30th, 2023
- Le cellule staminali del cancro al pancreas o CSC sono un sottoinsieme di cellule tumorali auto-rinnovabili e possono dare origine all'intero tumore. Le CSC risiedono in una nicchia ben protetta costituita da altre cellule, come fibroblasti, cellule immunitarie, cellule endoteliali e componenti della matrice extracellulare, come citochine e fattori di crescita. Le interazioni che avvengono tra le cellule in un tale ambiente aiutano le CSC a propagarsi e ad aumentare la crescita tumorale.
Per studiare le proprietà delle CSC, le isoliamo dai tumori del pancreas. Iniziare prelevando la sospensione cellulare dal tessuto tumorale pancreatico umano in un terreno di coltura CSC. Successivamente, seminare la sospensione, costituita principalmente da fibroblasti e CSC, su una piastra rivestita di gelatina e incubarla per la durata desiderata. I fibroblasti aderiscono alla superficie della gelatina, lasciando le CSC libere di fluttuare nella sospensione cellulare.
Prelevare una piccola quantità di sospensione cellulare e aggiungere il tripano blu. Pipettare questa miscela in un emocitometro e contare il numero di cellule vitali. Il blu di tripano entra nelle cellule morte e le colora di blu, lasciando le cellule vive incolori. Infine, conservare i CSC per ulteriori analisi.
Nel seguente protocollo, isoleremo le CSC dai tumori del pancreas.
- Per isolare le cellule staminali tumorali da un adenocarcinoma duttale pancreatico in una cappa di biosicurezza sterile, utilizzare un bisturi sterile e una pinza per tritare il tumore umano in una piastra di coltura di 60 x15 millimetri contenente un millilitro di PBS sterile, aggiungendo altri tre o quattro millilitri di PBS se necessario, fino a quando il tessuto non è completamente dissociato.
Trasferire la sospensione tissutale in una provetta conica sterile e aggiungere PBS fino a un volume finale di cinque millilitri. Quindi, omogeneizzare meccanicamente il campione con il dissociatore, centrifugare e digerire il tessuto omogeneizzato con collagenasi a 37 gradi Celsius.
Dopo un'ora, centrifugare le celle, risospendendo il pellet in 10 millilitri di terreno completo. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino da 40 micrometri e far girare nuovamente le cellule, questa volta risospendendo il pellet in cinque millilitri di ACK.
Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, rimuovere il tampone di lisi dei globuli rossi mediante centrifugazione e risospendere il pellet nel terreno delle cellule staminali tumorali. Quindi, incubare le cellule su un piatto rivestito di gelatina a 37 gradi Celsius per rimuovere la maggior parte delle cellule dei fibroblasti che si attaccano rapidamente. Dopo un'ora, recuperare il surnatante e quantificare il numero di cellule tumorali pancreatiche vitali.