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Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 4:24 min • April 30th, 2023
- Il ganglio della radice dorsale o DRG sono neuroni sensoriali che trasmettono messaggi dalla periferia al sistema nervoso centrale. Al contrario, i neuroni del plesso mienterico sono coinvolti nei movimenti peristaltici dell'intestino.
In condizioni tumorali come il cancro al pancreas, questi neuroni si alterano morfologicamente e funzionalmente. Per studiare i cambiamenti della morfologia neuronale, seminare le cellule neurali su vetrini coprioggetti pre-rivestiti con proteina laminina, posti in una piastra multipozzetto, e ricoprire le cellule con il mezzo basale neurale.
La proteina laminina promuove la crescita dei neuriti. Incubare le cellule durante la notte. Quindi, aggiungere il terreno di estrazione del tessuto del cancro al pancreas ai primi tre pozzetti e il terreno di estrazione del tessuto pancreatico sano ai tre pozzetti successivi. Incubare la piastra. Ora, eseguire la colorazione immunoistochimica utilizzando marcatori anticorpali neurone-specifici, che si legano ai neuroni. Posizionare il vetrino coprioggetti sul vetrino e posizionare il vetrino sotto un microscopio invertito. Misura la densità dei neuriti utilizzando il software.
I neuroni DRG coltivati nell'estratto di tessuto del cancro al pancreas di solito mostrano una maggiore densità di neuriti rispetto all'estratto di tessuto pancreatico sano. Al contrario, i neuroni del plesso mienterico formano neuriti più lunghi rispetto agli estratti di tessuto pancreatico sano. Nel seguente protocollo, eseguiremo un test di neuroplasticità in vitro su DRG di un topo neonato e sui neuroni del plesso mioenterico.
- Per preparare le cellule per la coltura, utilizzare un emocitometro per stimare il numero totale di neuroni e glia. Quindi, seminare le cellule su vetrini coprioggetti pre-rivestiti da 13 millimetri in una piastra a 24 pozzetti. Il rivestimento utilizzato dipende dagli obiettivi sperimentali. Quindi, ricopri i pozzetti con il terreno basale neurale e lascia che le cellule si attacchino ai pozzetti, durante la notte. Il giorno successivo, scongelare il terreno integrato con estratto tissutale o il terreno integrato con il surnatante della linea cellulare.
Successivamente, aspirare il terreno di semina dai DRG ed eseguire un lavaggio facoltativo molto delicato con PBS. Quindi, pipettare lentamente il terreno integrato con estratto di tessuto o il terreno integrato con surnatante della linea cellulare sulle cellule per ottenere 100 microgrammi per millilitro. Ora, lasciare che le cellule crescano per 48 ore a 37 gradi Celsius nell'estratto di tessuto o nel terreno fornito dal surnatante della linea cellulare. Dopo 48 ore, aspirare il terreno e fissare il 4% di paraformaldeide per l'immunocolorazione.
Per la doppia colorazione immunofluorescente, utilizzare marcatori neurone-specifici e glia-specifici. Per la morfometria, utilizzare un microscopio a luce invertita dotato di una telecamera CCD in combinazione con un software automatizzato per misurare la densità dei neuriti. Utilizzando l'ingrandimento 200X, misurare la densità dei neuriti delle colture neuronali sovrapponendo una griglia di 50 X 50 micron e contando la densità delle fibre per quadrato, misurata nelle fibre che si intersecano. Ripetere questa analisi per quattro diverse regioni di crescita più densa su quattro o cinque micrografie fotografiche rappresentative su ciascun vetrino coprioggetti.
Misurare la crescita dei neuriti, il numero medio di rami per neurone, la lunghezza media dei rami e le dimensioni pericarionali da 30 neuroni solitari selezionati casualmente da ciascun vetrino coprioggetti contrassegnando i neuriti e il perikarya.