Monitoraggio del microambiente tumorale basato su PTM: un metodo per monitorare i cambiamenti nella rigidità della ECM utilizzando gli sferoidi tumorali

- Nell'invasione tumorale, le cellule tumorali periferiche subiscono una transizione da epitelio a mesenchimale o EMT, con conseguente degradazione locale della matrice extracellulare o ECM. Possiamo studiare l'interazione delle cellule tumorali con la ECM in vitro.

Per studiare queste interazioni, trasferire uno sferoide preformato derivato da cellule tumorali pancreatiche su una piastra contenente scaffold di collagene insieme a sonde traccianti fluorescenti incorporate e terreni di coltura. Lo sferoide tumorale rilascia proteasi, che degradano il collagene e riducono la rigidità della MEC, determinando il libero movimento delle sonde traccianti nella MEC.

Incubare la piastra per la durata desiderata. Osservare il campione al microscopio ottico per osservare la griglia dei punti di campionamento nell'impalcatura di collagene e registrare i dati video da essi. La regione della matrice vicino allo sferoide mostra la massima degradazione del collagene. Pertanto, ha un aumento del movimento della sonda. Al contrario, l'area più lontana dallo sferoide mostra una minore degradazione del collagene, con conseguente limitazione del movimento delle molecole della sonda.

Questa tecnica di esame delle proprietà reologiche della MEC misurando le traiettorie delle particelle traccianti è nota come microreologia a tracciamento delle particelle o PTM. Nel seguente protocollo, eseguiremo un saggio di formazione di sfere per identificare le cellule staminali del cancro del pancreas e valutare l'effetto della metformina.

Per iniziare, preparare una postazione di lavoro all'interno di una cappa a flusso laminare con due fiale da 2 millilitri. La fiala 1 conterrà lo sferoide tumorale e la fiala 2 sarà un controllo senza cellule. Preparare una miscela diluita di sonde traccianti fluorescenti modificate con carbossilato di diametro di 1 micron aggiungendo 2 parti di sonde stock a 25 parti di acqua sterile.

Togliete dal frigorifero una bottiglia di 3,1 milligrammi per millilitro di collagene bovino e mettetela sul ghiaccio. Aliquotare 125 microlitri di collagene seguiti da 50 microlitri di soluzione diluita della sonda tracciante nel flaconcino 1. Vorticare brevemente per distribuire le sonde.

Quindi, aggiungere 235 microlitri di terreno di coltura cellulare appropriato contenente rosso fenolo per un volume totale di 410 microlitri e agitare brevemente prima di rimuovere 205 microlitri e metterli nella fiala 2. Successivamente, aggiungere circa 2 microlitri di idrossido di sodio 1 molare al flaconcino 1 per riportare la soluzione a pH neutro. Agitare brevemente per mescolare. Quindi, rimetti immediatamente sulla griglia del ghiaccio in modo che la miscela non inizi a polimerizzare.

Rimuovere delicatamente 40 microlitri di terreno dal pozzetto contenente lo sferoide tumorale. Conservare questi 40 microlitri durante il passaggio successivo. Controlla il pozzo per vedere se lo sferoide è stato rimosso nel passaggio precedente. In caso contrario, rimetti i 40 microlitri nel pozzetto e ripeti il passaggio precedente.

Se lo era, aggiungere i 40 microlitri contenenti lo sferoide alla fiala 1. Mescolare delicatamente il flaconcino 1 prima di trasferire la miscela in porzioni da 60 microlitri in tre pozzetti separati di una piastra da 96 pozzetti. Ispezionare ogni pozzetto con un microscopio dopo aver aggiunto la miscela per determinare quale pozzetto contiene lo sferoide.

Quindi aggiungere circa 2 microlitri di idrossido di sodio 1 molare e 40 microlitri di terreno di coltura cellulare alla fiala 2 e agitare prima di aliquotare 60 microlitri di questa miscela in un pozzetto vuoto nella piastra a 96 pozzetti ed etichettarla come controllo senza cellule. Metti la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per indurire per almeno un'ora.

Per costruire una griglia di punti di campionamento, per prima cosa, trasferire la piastra del campione dall'incubatore al tavolino del microscopio. Attendere 10 minuti affinché il campione si equilibri a temperatura ambiente se non è disponibile un tavolino riscaldato. Osservare il campione con lenti dell'obiettivo a bassa potenza per assicurarsi che sia intatto e pronto per l'imaging. Determinare la posizione del tumore all'interno del pozzetto e documentarla con un'immagine a luce trasmessa per la successiva coregistrazione spaziale.

Tipicamente, 20 punti di campionamento in ciascun pozzetto distribuiti in anelli concentrici attorno allo sferoide produrranno risultati adeguatamente dettagliati. Spostare il tavolino in ogni posizione desiderata e utilizzare il software di interfacciamento del microscopio per registrare le coordinate x e y.

Passare il microscopio a una lente dell'obiettivo ad alta potenza e selezionare il cubo del filtro appropriato per la lunghezza d'onda di eccitazione delle sonde traccianti. Utilizzando l'elenco dei punti creati, spostatevi al primo punto della griglia. Regola la messa a fuoco per trovare il fondo del pozzetto prima di spostarti verso l'alto per trovare un campo visivo contenente diverse sonde traccianti a fuoco.

Osservare l'istogramma dell'intensità e regolare l'intensità e il tempo di esposizione per ottenere la massima gamma dinamica possibile, assicurandosi che l'immagine non si saturi. Ottenete una sequenza video con una frequenza fotogrammi compresa tra 20 e 30 millisecondi per fotogramma e salvatela con una convenzione di denominazione appropriata. Durante la registrazione, non toccare il microscopio o il tavolo.

Ripetere la registrazione per ogni punto di campionamento nella griglia. Quindi procedere a ripetere il processo per costruire una griglia per ogni pozzo nell'esperimento e ripetere l'intero processo per ogni punto temporale per tutta la durata del monitoraggio longitudinale.