Modelli murini di metastasi spontanee: una piattaforma per studiare il potenziale metastatico delle cellule di cancro colorettale iniettate ortotopicamente

- Iniziare con una coltura di proteina fluorescente verde, o GFP, che esprime organoidi di cancro del colon-retto. Raccogli gli organoidi. Trattare con una soluzione enzimatica di distacco cellulare per dissociare gli organoidi in una sospensione unicellulare. Centrifugare per separare il surnatante contenente enzima. Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule tumorali del colon-retto che esprimono GFP utilizzando un terreno artificiale contenente matrice extracellulare. Caricare la sospensione cellulare in una siringa e mantenerla sul ghiaccio per evitare la solidificazione della matrice a temperatura ambiente.

Quindi, prepara un topo anestetizzato in posizione supina. Estrarre delicatamente lo strato mucoso del retto attraverso l'apertura anale. Ora, iniettare la sospensione di cellule tumorali che esprimono GFP preparata nello strato sottomucoso rettale contenente la rete di vasi sanguigni. Consenti al mouse di riprendersi.

Entro pochi giorni, un tumore primario che esprime GFP si sviluppa nel sito di iniezione. Con le metastasi spontanee, queste cellule tumorali si staccano ed entrano in circolo. Alla fine, le cellule si stravasano in organi distanti e proliferano per formare tumori metastatici GFP-positivi. Nel seguente protocollo, mostreremo la generazione di un modello murino di metastasi spontanee di cancro del colon-retto iniettando ortotopicamente cellule organoidi colorettali che esprimono GFP.

- Per stabilire un modello murino di metastasi spontanee di xenotrapianti tumorali derivati da pazienti con CRC, dissociare gli organoidi marcati con GFP come dimostrato e diluire le sospensioni di singole cellule tumorali a una velocità di 5 volte 10 per 50 microlitri di PBS, integrata con una concentrazione di matrice extracellulare artificiale del 50%. Caricare 50 microlitri di cellule per topo in una siringa dotata di ago calibro 22 e posizionare le cellule tumorali sul ghiaccio.

Successivamente, confermare la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e posizionare il primo topo NOG anestetizzato in posizione supina sul banco del laboratorio. Usando una pinzetta sterile, estrarre delicatamente la mucosa rettale dall'ano e iniettare immediatamente le cellule tumorali nella sottomucosa rettale.