Saggio di organizzazione del citoscheletro e dell'adesione focale: un metodo basato sull'immunofluorescenza per studiare l'adesione cellulare e la diffusione su substrati

- La morfologia del substrato influenza notevolmente il comportamento delle cellule tumorali e le risposte metastatiche. Una rete dinamica di citoscheletro di actina fornisce supporto strutturale alle cellule e media il movimento cellulare. Grandi complessi proteici associati alla membrana chiamati aderenze focali collegano il citoscheletro con la matrice extracellulare, facilitando la diffusione cellulare.

Per iniziare la colorazione, prendi una coltura di cellule tumorali e trattale con paraformaldeide per fissare e permeabilizzare le cellule. Ora, incubare le cellule con un reagente potenziatore del segnale contenente proteine per preparare le cellule a ridurre la colorazione di fondo. Aggiungere anticorpi primari anti-vinculina che si legano alla vinculina, una delle proteine all'interno del complesso di adesione focale.

Successivamente, incubare il campione con un anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente mirato all'anticorpo primario. Infine, trattare le cellule con coniugati falloidinici marcati in fluorescenza che si legano selettivamente ai filamenti di actina del citoscheletro. Osservare le cellule sotto un microscopio a scansione laser confocale per studiare i loro segnali fluorescenti.

Le cellule con morfologia ben diffusa presentano fibre di actina definite e presentano aderenze focali distinte e allungate contenenti vinculina. Al contrario, le cellule scarsamente diffuse non possiedono filamenti di actina definiti, ma mostrano aderenze focali puntite contenenti vinculina. Nel seguente protocollo, dimostreremo un test di immunofluorescenza per studiare il citoscheletro e l'organizzazione dell'adesione focale nelle cellule tumorali primarie del colon.

- Portare i substrati da immunocolorare sulla cappa laminare e rimuovere il terreno di coltura. Quindi, sciacquare i substrati con soluzione salina tamponata con fosfato, o PBS, e fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare i substrati con PBS per cinque minuti, per un totale di tre volte. Quindi, incubare i substrati con 500 microlitri di potenziatore del segnale per 30 minuti prima di risciacquare con PBS.

Successivamente, incubare le cellule con anticorpo monoclonale anti-vincolina a una diluizione da 1 a 250 in PBS per 45 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare i substrati con PBS per cinque minuti per un totale di tre volte. Incubare i campioni con un anticorpo secondario Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG a una diluizione da 1 a 200 in PBS a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, lavare nuovamente i substrati con PBS per cinque minuti per un totale di tre volte.

Per visualizzare la struttura della F-actina, incubare le cellule con coniugati tetrametilrodamina-falloidina a una concentrazione di 50 microlitri per millilitro per 45 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare nuovamente i substrati come prima. Infine, procedere all'imaging dei campioni utilizzando un microscopio laser a scansione confocale.