JoVE Encyclopedia of Experiments
Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 4:23 min • April 30th, 2023
- Le cellule staminali dei melanociti quiescenti, in risposta alle radiazioni UV o alla depilazione dei capelli, si attivano. Le cellule staminali attivate del melanoma possono portare al melanoma cutaneo, una forma di cancro della pelle. Per studiare il melanoma, prepariamo blocchi di tessuto cutaneo congelato per mantenere le strutture native del DNA e delle proteine durante la procedura di fissaggio.
Inizia posizionando un topo melanoma soppresso su un lettino chirurgico e rimuovi i peli dalla regione dorsale della pelle sopra la coda. Asportare la pelle e coprirla con una carta da filtro. Successivamente, immergere la carta da filtro contenente tessuto cutaneo in formalina tamponata neutra per il tempo desiderato. La formalina penetra nel tessuto cutaneo e si lega agli aminoacidi, provocando la reticolazione delle proteine, portando quindi alla fissazione dei tessuti.
Rimuovere il fazzoletto cutaneo dalla carta e tagliare il fazzoletto per ottenere pezzi della dimensione desiderata. Ora, incorporare i pezzi di tessuto verticalmente in un criomold riempito con terreno OCT e posizionare i criostampi su ghiaccio secco. L'OCT è una matrice di campioni che si solidifica al congelamento e forma uno strato gelatinoso attorno al campione di tessuto che lo tiene in posizione. Utilizzare i blocchi congelati per ulteriori saggi istologici. Nel seguente protocollo, prepareremo blocchi di tessuto cutaneo congelati dalla pelle dorsale murina per studiare il melanoma cutaneo.
- Per isolare i campioni di pelle, utilizzare un rifinitore elettrico per rimuovere eventuali peli dall'area della pelle dorsale dei topi irradiati soppressi e spazzolare leggermente la pelle esposta con un panno privo di lanugine per liberare l'area. Fai una piccola incisione con le forbici affilate appena sopra la base della coda e inserisci grandi forbici smussate nell'incisione per separare i tessuti connettivi sottocutanei. Utilizzando le forbici affilate, tagliare con cura lungo il bordo della regione cutanea di interesse per isolare il campione di tessuto e posizionare il tessuto cutaneo asportato su un tovagliolo di carta pulito.
Quindi, usa una pinza opaca per allungare la pelle in modo che aderisca all'asciugamano e sia tesa. Quando tutti i campioni sono stati raccolti, posizionare il campione di pelle e il supporto di carta assorbente in un pezzo di carta da filtro piegato immediatamente adiacente alla piega, facendo attenzione che il campione sia liscio e non piegato o accartocciato. Chiudere i lati della carta da filtro con punti metallici e rifilare la carta. Quindi, immergere completamente i campioni in formalina tamponata neutra al 10% per 3-5 ore a temperatura ambiente prima di lavare i tessuti con due lavaggi di 5 minuti in acqua deionizzata.
Dopo il secondo lavaggio, rimuovere con cura eventuali residui di materiale dai tessuti cutanei e rifilare i bordi del campione in modo che non siano frastagliati. Successivamente, eseguire tre tagli sagittali in ciascun campione in modo che la larghezza delle strisce non sia superiore a 5 millimetri e praticare tagli trasversali in modo che i campioni non siano larghi più di 20 millimetri. Posiziona un criomold contenente la temperatura di taglio ottimale o il mezzo OCT in un orientamento verticale e posiziona quattro o cinque pezzi di pelle sopra l'OCT.
Quando tutti i pezzi sono in posizione, utilizzare due paia di pinze sottili per portare il bordo lungo di ogni pezzo di pelle sul fondo del criomold in modo che i campioni siano verticali all'interno dell'OCT e perpendicolari alla base dello stampo. Quindi, riempi lo stampo con altro OCT fino al secondo labbro e posiziona lo stampo su una superficie piana di un pezzo di ghiaccio secco, usando una pinza per regolare eventuali pezzi di pelle che potrebbero essersi spostati durante il trasferimento mentre il blocco inizia a congelarsi secondo necessità.