Embrionali di topo Cultura Lung, un sistema per valutare i meccanismi molecolari della Branching
30 giugno 2010
Embrionale precoce cultura organo polmonare è un sistema molto utile per studiare le interazioni epitelio-mesenchimali. Procede morfogenesi entrambi epiteliali e mesenchimali in condizioni specifiche che possono essere facilmente manipolati in questo sistema.
In questo video viene dimostrato un metodo per la dissezione e la coltura dei polmoni embrionali di topo. La procedura inizia con il prelievo di embrioni a E 11.5 o E 12.5. Successivamente, gli embrioni vengono aperti e i polmoni vengono estratti.
I polmoni vengono quindi piastrati in un'interfaccia di aria liquida e incubati dopo coltura. I cambiamenti nella crescita e nella ramificazione del mesen chy e dell'epitelio del polmone embrionale in risposta a trattamenti specifici possono essere osservati utilizzando uno stereomicroscopio. Ciao, sono David War Burton.
Dirigo il programma di biologia dello sviluppo e medicina rigenerativa presso il Ban Research Institute Children's Hospital di Los Angeles. E io sono Jan Carro, un postdoc senior presso il Dr.War Burton Lab. Oggi vi mostreremo una tecnica per isolare il polmone embrionale di topo e metterlo in coltura d'organo.
Questa tecnica si è evoluta dalla descrizione originale di Tina Jaco Halkin e Pablo ci ha portato alla USC School of Dentistry circa 20 anni fa. Usiamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la morfia ramificata dell'agnello. Quindi iniziamo.
Il giorno 11.5 o 12.5 postum, posizionare un topo gravido a tempo sacrificato con anidride carbonica sotto una cappa a flusso laminare sul suo dorso. Spruzzare con il 70% di etanolo. Fai un'incisione nell'addome.
Quindi, tenendo le zampe posteriori dell'animale, rimuovere la pelle tirando verso l'alto. Aprire la cavità peritoneale e rimuovere l'utero. Posizionare l'utero in una provetta conica da 50 millilitri riempita con matasse fredde, soluzione salina bilanciata o HBSS e agitare delicatamente per due minuti per risciacquare il sangue.
Successivamente, trasferire l'utero in una capsula di Petri sotto un microscopio da dissezione stereoscopico. Usando le forbici a molla, taglia la parete uterina per rilasciare gli embrioni. Quindi, utilizzando un cucchiaio forato, raccogliere gli embrioni e metterli in una capsula di Petri contenente HBSS e metterli sul ghiaccio.
Continuare a lavorare sotto il microscopio da dissezione stereoscopica e iniziare a sezionare i polmoni embrionali. Inizia posizionando l'embrione sul lato sinistro. Usando il forcipe, rimuovere l'arto anteriore destro che tiene il forcipe nella mano sinistra.
Tagliare l'embrione partendo dall'apertura dell'arto e rimuovere la pelle. Questo passaggio ti permetterà di vedere gli organi interni e di localizzare il cuore e i polmoni per il passaggio successivo. Togliete il cuore.
I polmoni embrionali si trovano posteriormente al cuore e anteriormente alla colonna vertebrale. Quindi, separare il polmone intatto dall'embrione. Quindi tagliare via il tessuto estraneo e l'esofago.
Una volta rimossi i polmoni, utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per trasferirli in una piastra di Petri contenente HBSS freddo su ghiaccio. Ad ogni pozzetto di un piatto di polistirene delta senza clone a 0,5 a un millilitro di D-M-E-M-F 12 integrato con 50 unità per millilitro di streptomicina penicillina. Successivamente, posizionare una membrana di incisione della traccia in policarbonato sulla parte superiore del supporto, con il lato lucido rivolto verso il basso e il lato ruvido rivolto verso l'alto.
Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, posizionare un polmone embrionale sezionato sopra la membrana di incisione della traccia in policarbonato nucleo. Utilizzando lo stereomicroscopio, regolare la posizione del polmone embrionale. Il polmone embrionale dovrebbe avere una trachea intatta posta in posizione diritta, come mostrato qui.
Ciò garantisce che tutti i polmoni abbiano la stessa pressione interna, trasferisca la piastra in un incubatore cellulare e la coltura per il tempo desiderato. Qui, i polmoni di E 12,5 sono stati coltivati in presenza o in assenza di FGF nove. FGF nine è un membro della famiglia dei fattori di crescita dei fibroblasti che induce l'espansione del mechy e la dilatazione dell'epitelio nei polmoni cresciuti in vitro dopo 48 ore.
In assenza di FGF nove, si osserva un aumento delle ramificazioni. Queste immagini sono fotografie del polmone embrionale scattate al microscopio stereoscopico. Al contrario, i polmoni cresciuti 48 ore in presenza di FGF nove hanno epitelio dilatato e mechy.
Dopo 24 ore di cultura. Dopo 48 ore, l'effetto sull'epitelio è ancora più pronunciato. Quindi ti abbiamo appena mostrato come preparare colture di organi da polmone di topo embrionale.
Quando si esegue questa procedura è importante ricordarsi di rimuovere il polmone dall'embrione il prima possibile per ridurre il deterioramento dei tessuti. Quindi grazie per aver guardato. Speriamo che troverai questa tecnica utile.
Buona fortuna con i tuoi esperimenti.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per isolare e coltivare polmoni embrionali di topo per studiare le interazioni epiteliali-mesenchimali. La tecnica permette l'osservazione di cambiamenti nella crescita e nel ramificarsi in risposta a trattamenti specifici.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biologia dello sviluppo
- Medicina rigenerativa
- Tecniche di coltura d'organo
Conoscenze di base
- La coltura d'organo polmonare embrionale è cruciale per studiare lo sviluppo polmonare.
- Le interazioni epiteliali-mesenchimali sono fondamentali per comprendere la morfogenesi polmonare.
- Il metodo permette la manipolazione delle condizioni di coltura.
- Le tecniche precedenti si sono evolute nel corso degli anni per ottenere risultati migliori.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare un metodo affidabile per isolare polmoni embrionali di topo.
- Osservare gli effetti di trattamenti specifici sullo sviluppo polmonare.
- Fornire una risorsa per i ricercatori che studiano la biologia polmonare.
Metodi utilizzati
- Sezione di embrioni di topo a E 11.5 o E 12.5.
- Isolamento dei polmoni embrionali sotto un microscopio stereo.
- Coltura dei polmoni in un'interfaccia aria-liquido.
- Osservazione della crescita e del ramificarsi mediante microscopia.
Risultati principali
- Il trattamento con FGF9 porta alla dilatazione dell'epitelio e del mesenchima.
- Si osserva un aumento del ramificarsi in assenza di FGF9.
- I cambiamenti nella morfologia polmonare possono essere documentati nel tempo.
- La tempistica corretta nella rimozione dei polmoni è fondamentale per ridurre il deterioramento dei tessuti.
Conclusioni
- Il metodo è efficace per studiare lo sviluppo polmonare embrionale.
- Le tecniche di coltura d'organo possono rivelare importanti interazioni biologiche.
- Questo approccio può essere utilizzato in vari contesti sperimentali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This embryonic lung culture system enables mechanistic interrogation of epithelial-mesenchymal signaling pathways critical for lung branching morphogenesis. By providing a defined, serum-free platform to manipulate growth factors like FGF9, it supports target validation and de-risking in pulmonary therapeutic discovery. The model offers translational relevance for identifying modulators of lung development and repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional testing of mesenchymal-derived inductive signals on epithelial branching and morphogenesis.
- Operational Value: Supports gain- and loss-of-function studies using recombinant proteins, viral vectors, or RNAi to validate target specificity.
- Predictive Value: Quantifies structural outcomes such as epithelial dilation and mesenchymal expansion in response to pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a reproducible liquid air interface culture system for consistent lung explant growth and branching analysis.
- Quantitative Output: Enables morphometric measurement of epithelial dilation, mesenchymal expansion, and branching frequency under stereo microscopy.
- <Scalability: Compatible with multi-well formats for parallel compound or genetic perturbation screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models early lung morphogenesis to inform congenital disorder mechanisms and regenerative strategies.
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage pathway modulation with preclinical evaluation of lung repair or fibrosis interventions.
- Mechanistic De-risking: Clarifies epithelial-mesenchymal crosstalk to reduce ambiguity in target selection for pulmonary therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where pathway-specific modulation is tested in a physiologically relevant, ex vivo organ system prior to in vivo validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of fibroblast growth factor and other signaling pathways in lung development.
- Screening: Provides a standardized platform for assessing compound effects on lung morphogenesis with quantitative imaging readouts.
- Analytics: Generates morphological and spatial data enabling comparison of treatment conditions across experimental groups.
- Translational Research: Supports continuity from mechanistic insight to preclinical models of lung injury or developmental repair.
- Enterprise Reuse: Defined, serum-free conditions allow adaptation across labs and projects studying pulmonary morphogenesis or repair.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in lung development pathways through direct observation of epithelial-mesenchymal interactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized dissection, culture, and imaging protocols under controlled conditions.
- Strategic Value: Improves target confidence by linking molecular perturbations to quantifiable structural outcomes in a developing organ.
- Portfolio Impact: Enables early de-risking of pulmonary targets by validating functional relevance in a human-relevant developmental system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection and sterile tissue handling under stereo microscopy.
- Depends on access to cell culture incubators, sterile transfer tools, and defined media components.
- Necessitates standardization of embryo staging (E11.5–E12.5) and lung isolation timing to minimize variability.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of dissection and culture conditions.
- Practical limitations include tissue viability window and dependence on precise embryonic staging.
