Name: Embrionali di topo Cultura Lung, un sistema per valutare i meccanismi molecolari della Branching (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Scopri la coltura di polmoni embrionali di topo per studiare le interazioni epitelio-mesenchimali e la morfogenesi polmonare. Questo metodo permette di osservare la crescita e il branching in risposta a trattamenti specifici.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Saban Research Institute di pre-dottorato Award (PMDM), e dal NIH RO1 HL75773 (DW).

Cultura d'organo è una tecnica molto utile e versatile per lo studio dell'espressione genica e proteica. Questi metodi di coltura ex vivo può essere utilizzato come preliminare o in modo complementare agli studi in vivo. 1. Polmone embrionale di isolamento <ol><li> Cronometrato in gravidanza topi vengono sacrificati il giorno postcoitum 11,5 o 12,5 (E11.5-12.5) narcosi da CO 2 secondo le linee guida NIH e OLAW. L'animale è posto in una camera e 2 CO 100% è introdotto. Dopo che l'animale è incosciente il flusso di CO 2 è aumentata. La morte clinica degli animali deve essere garantita. </li><li> Tutte le seguenti operazioni devono essere completate in condizioni di sterilità in una cappa a flusso laminare. L'utero viene rimosso dalle femmine gravide. Per rimuovere l'utero dall'animale, le femmine gravide sono posizionati sul dorso e spruzzato con il 70% di etanolo. Un'incisione è fatta nell'addome, e la pelle viene rimossa tirando la pelle verso l'alto tenendo le zampe posteriori dell'animale. La cavità peritoneale è aperta e l'utero viene rimosso dal animale. </li><li> Il sangue è risciacquate mettendo l'utero in un tubo da 50 ml conica riempita con la soluzione a freddo sale Hanks Bilanciato (HBSS), e il tubo è cullati dolcemente per 2 minuti. </li><li> L'utero è poi posto in una capsula di Petri sotto il microscopio stereoscopico dissezione, e gli embrioni liberati dall'utero di incidere la parete uterina con le forbici a molla. Gli embrioni vengono raccolte con un mestolo forato, e immessi sul ghiaccio in un nuovo piatto di Petri contenenti HBSS. </li><li> Sotto il microscopio stereoscopico dissezione, i polmoni embrionali sono sezionati uno ad uno in una capsula di Petri contenente HBSS freddo (Figura 1). </li><li> Il polmone isolato embrionale è immesso sul ghiaccio in una capsula di Petri contenente HBSS con una pipetta sterile trasferimento. </li></ol> 2. Cultura polmone embrionale <ol><li> 500 microlitri a 1 millilitro di D-MEM/F-12 ben integrata con 50 unità / ml di penicillina-streptomicina viene aggiunto in un piatto di polistirolo Nunclon. </li><li> Un Nuclepore policarbonato Track-Etch membrana è posta sulla parte superiore del supporto. Quando il Nuclepore policarbonato Track-Etch membrana è posto sulla parte superiore del supporto, accertarsi che il lato lucido è contro i media, e parte ruvida è rivolto verso l'alto. </li><li> Un polmone sezionato embrionale è posto sulla parte superiore del policarbonato Nuclepore Track-Etch a membrana con una pipetta sterile trasferimento. </li><li> La posizione del polmone embrionale viene regolata utilizzando il forcipe. Polmone embrionale immessi sul filtro dovrebbe avere un trachea intatto ed essere posizionati con le loro trachea avere una posizione diritta, consentendo così a tutti i polmoni di avere la stessa pressione interna. </li><li> Il piatto polistirene Nunclon è trasferita per il tempo desiderato cultura in un incubatore cella (Figura 2). </li></ol> 3. Materiale 1. Embrionale isolamento intero polmone <ol><li> Temporizzata in gravidanza (C57BL6 wild-type o transgenici) topi essere sacrificato il giorno postcoitum 11,5-13,5 (E11.5-13.5). </li><li> Sale Hanks 'soluzione equilibrata (HBSS) (1X), liquido, senza cloruro di calcio, cloruro di magnesio o solfato di magnesio. (Invitrogen, Carlsbad, CA) integrata con 50 unità / ml di penicillina-streptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Conservare il HBSS a temperatura ambiente ed a 4 ° C dopo l'apertura. Aliquota e memorizzare la penicillina-streptomicina a -20 ° C. </li><li> Stereoscopico microscopio da dissezione (Leica, Wetzlar, Germania). </li><li> Strumenti di dissezione tra cui Dumont pinze, forbici Belle iris (diritto), Noyes forbici primavera e Moria cucchiaio ® (forato) (Strumenti Scienza Fine, Foster City, CA). </li></ol> 2. Embrionale Cultura intero polmone <ol><li> Dulbecco Modified Media Aquila: Mix nutrienti F-12 (D-MEM/F-12) (1X), liquido, 1:1 Contiene L-glutamina, ma nessun tampone HEPES. (Invitrogen, Carlsbad, CA) integrata con 50 unità / ml di penicillina-streptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tenere il DMEM/F-12 bottiglia al riparo dalla luce (ad esempio coperto da un foglio di alluminio) e conservare a 4 ° C. Aliquota e memorizzare la penicillina-streptomicina a -20 ° C. </li><li> Nuclepore policarbonato Track-Etch a membrana, 8.0-m, 13mm (Whatman Nuclepore Track-Etch membrana (Whatman, Florham Park, NJ). </li><li> Nunclon piatto di polistirolo con coperchio, 4 pozzi (Rochester, NY). </li><li> Pipette di trasferimento monouso, sterili (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Dissezione di E12 polmoni embrionale. (A) E12.5 embrione tutto visto dal lato destro. (B) zampa anteriore destra è stato rimosso dall'embrione. (C) Pinza teneva per la mano sinistra regge l'embrione costante nel piatto. Le frecce indicano piano di dissezione (D) del polmone embrionale si trova posteriormente al cuore (rimossa) E anteriore alla colonna vertebrale. Questa figura mostra i polmoni dopo la rimozione della pelle e del cuore. (E) la rimozione Faringe consente la separazione del polmone intatto dall'embrione. (F) estranei tessuto della faringe ed esofago sono stati tagliati via. Sezionato E12.5 polmone embrionale con la trachea e della laringe intatta viene mostrato. (Cr) lobo craniale, (Med) lobo mediale, (Ca) lobo caudale, (Acc) lobo accessorio, (Le) lobo sinistro. <img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. FGF9 induce espansione del mesenchima e la dilatazione dei polmoni in epitelio coltivate in vitro. (AC) E12.5 polmonare è cresciuto per 48 ore in assenza di FGF9. Si noti l'aumento della ramificazione. (DF) E12.5 polmone cresciuto per 48 ore in presenza di FGF9. Si noti la dilatazione dei epitelio e mesenchima già dopo 24 ore di cultura (E). Dopo 48 ore (F), l'effetto sul epitelio è ancora più pronunciato. Scala grafica: AF 400 micron 4. Il protocollo testo completo di questo approccio sperimentale è disponibile in <a href="http://springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-019-5_5">protocolli di Springer</a> .

<ol><li>Alescio, T., Cassini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+in+vitro+of+tracheal+buds+by+pulmonary+mesenchyme+grafted+on+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium.</a> J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).</li>
<li>Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of lung morphogenesis.</a> Mech Dev. 92, 55-81 (2000).</li>
<li>Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+in+mammalian+organ+development%3A+differentiation+of+cultured+lung+and+pancreas+rudiments+during+spaceflight%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight.</a> J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).</li>
<li>Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+FGF9+on+epithelium+and+mesenchyme+in+mouse+embryonic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung.</a> Dev Biol. 293, 77-89 (2006).</li>
<li>Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+mouse+lung+morphogenesis+and+type+II+cytodifferentiation+in+serumless%2C+chemically+defined+medium+using+prolonged+in+vitro+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures.</a> Cell Differ. 24, 105-117 (1988).</li>
<li>Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epidermal+growth+factor+expression+in+early+mouse+embryo+lung+branching+morphogenesis+in+culture%3A+antisense+oligodeoxynucleotide+inhibitory+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy.</a> Dev Biol. 158, 555-559 (1993).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

embrionali di topo cultura lung, un sistema per valutare i meccanismi molecolari della branching

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Specifiche del polmone primordiale così come morfogenesi ramificazione, e la formazione di varie linee cellulari polmonare richiede una interazione specifica del polmone endoderma con i suoi mesenchima circostante e mesotelio. Mesenchima del polmone ha dimostrato di essere la fonte di segnali induttivi per la morfogenesi del polmone ramificazione. Epitelio-mesenchimale-mesoteliali interazioni sono anche fondamentali per la morfogenesi del polmone embrionale. Embrionale precoce cultura organo polmonare è un sistema molto utile per studiare le interazioni epitelio-mesenchimali. Procede morfogenesi entrambi epiteliali e mesenchimali in condizioni specifiche che possono essere facilmente manipolati in questo sistema (in assenza di influenza materna e il flusso di sangue). Ancora più importante questa tecnica può essere facilmente fatto in un serumless, terreni di coltura chimicamente definite. Guadagno e perdita della funzione può essere raggiunto utilizzando proteine ​​espresse, vettori virali ricombinanti e / o analisi dei ceppi di topi transgenici, RNA antisenso, così come knockdown interferenza dell&#39;RNA del gene.

Embrionale precoce cultura organo polmonare è un sistema molto utile per studiare le interazioni epitelio-mesenchimali. Procede morfogenesi entrambi epiteliali e mesenchimali in condizioni specifiche che possono essere facilmente manipolati in questo sistema.

Embrionali di topo Cultura Lung, un sistema per valutare i meccanismi molecolari della Branching

La specificazione primordiale del polmone, così come la morfogenesi ramificata e la formazione di vari lignaggi cellulari polmonari, richiedono un'interazione specifica di...

In questo video viene illustrato un metodo per la dissezione e la coltura dei polmoni embrionali di topo. La procedura inizia con il prelievo di embrioni a E 11,5 o E 12,5. Successivamente, gli embrioni vengono aperti ed i polmoni sono estratti.I polmoni vengono quindi seminati in un'interfaccia liquido-aria e incubati secondo le condizioni di coltura. È possibile osservare, mediante microscopio stereoscopico, i cambiamenti nella crescita e nella ramificazione del mesenchima e dell'epitelio del polmone embrionale in risposta a trattamenti specifici. Ciao, sono David War Burton.Dirigo il programma di biologia dello sviluppo e medicina rigenerativa presso l'Istituto di Ricerca Ban del Children's Hospital di Los Angeles. E io sono Jan Carro, ricercatrice post-dottorato senior nel laboratorio della dottoressa War Burton. Oggi vi mostreremo una tecnica per isolare il polmone di topo embrionale e coltivarlo in organocultura.Questa tecnica si è evoluta dalla descrizione originale di Tina Jaco Halkin e Pablo presso la USC School of Dentistry circa 20 anni fa. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la morfogenesi della ramificazione del polmone. Cominciamo dunque.Al giorno 11,5 o 12,5 post coitum, posizionare una topolina gravida sacrificata con anidride carboniosa sotto una cappa a flusso laminare, in posizione supina. Spruzzare con etanolo al 70%. Praticare un'incisione sull'addome.Quindi, tenendo le zampe posteriori dell'animale, rimuovere la pelle tirando verso l'alto. Aprire la cavità peritoneale ed estrarre l'utero. Posizionare l'utero in un tubo conico da 50 millilitri riempito con soluzione salina equilibrata di Hank fredda o HBSS ed agitare delicatamente per due minuti per rimuovere il sangue.Successivamente, trasferire l'utero in una piastra di Petri sotto un microscopio stereoscopico per dissezione. Utilizzando forbici a molla, tagliare la parete uterina per liberare gli embrioni. Quindi, utilizzando un cucchiaio forato, raccogliere gli embrioni e posizionarli in una piastra di Petri contenente HBSS, ponendo il tutto sul ghiaccio.Continuare a lavorare sotto il microscopio stereoscopico da dissezione e iniziare a dissezionare i polmoni embrionali. Posizionare innanzitutto l'embrione sul suo lato sinistro. Utilizzando pinzette, rimuovere l'arto anteriore destro tenendo le pinzette nella mano sinistra.Tagliare l'embrione a partire dall'apertura degli arti e rimuovere la pelle. Questo passaggio permetterà di visualizzare gli organi interni e di localizzare il cuore e i polmoni per il passaggio successivo. Rimuovere il cuore.I polmoni embrionali si trovano posteriormente al cuore e anteriormente alla colonna vertebrale. Successivamente, separare il polmone integro dall'embrione. Quindi rimuovere i tessuti estranei e l'esofago.Dopo aver rimosso i polmoni, utilizzare una pipetta sterile per trasferirli in una piastra di Petri contenente HBSS freddo su ghiaccio. Aggiungere in ogni pozzetto di una piastra in polistirene no clone delta da 0,5 a un millilitro di D-M-E-M-F 12 integrato con 50 unità per millilitro di penicillina-streptomicina. Successivamente, posizionare una membrana in policarbonato nucleo con traccia incisa sopra il mezzo, con il lato lucido verso il basso e il lato ruvido verso l'alto.Utilizzando una pipetta sterile da trasferimento, posizionare un polmone embrionale dissezionato sulla membrana in policarbonato nucleporo. Mediante il microscopio stereoscopico, regolare la posizione del polmone embrionale. Il polmone embrionale deve avere una trachea integra posizionata in modo lineare, come mostrato qui.Questo garantisce che tutti i polmoni abbiano la stessa pressione interna; trasferire la piastra in un incubatore cellulare e coltivare per il tempo desiderato. In questo caso, i polmoni di E 12,5 sono stati coltivati in presenza o assenza di FGF nove. FGF nove è un membro della famiglia dei fattori di crescita dei fibroblasti che induce l'espansione del mesenchima e la dilatazione dell'epitelio nei polmoni coltivati in vitro dopo 48 ore.In assenza di FGF nine, si osserva un aumento della ramificazione. Queste immagini sono fotografie del polmone embrionale scattate al microscopio stereoscopico. Al contrario, i polmoni coltivati per 48 ore in presenza di FGF nine presentano un epitelio dilatato e mechy.Dopo 24 ore di coltura. Dopo 48 ore, l'effetto sull'epitelio è ancora più pronunciato. Abbiamo quindi appena mostrato come preparare colture organotipiche di polmone di topo embrionale.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di rimuovere il polmone dall'embrione il prima possibile per ridurre il deterioramento del tessuto. Grazie quindi per aver guardato. Speriamo che troviate questa tecnica utile.In bocca al lupo per i tuoi esperimenti.

mouse-embryonic-lung-culture-system-to-evaluate-molecular-mechanisms

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Qui, descriviamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di cellule murine endoteliali polmonari. Questo metodo comprende meccanico e dissociazione enzimatica tessuto polmonare e una 2-step processo di purificazione con anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2 anticorpi coniugati a sfere magnetiche, che produce una popolazione pura di cellule endoteliali di origine per lo più microvascolare.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Forze meccaniche svolgono un ruolo chiave nello sviluppo del polmone e danno polmonare. Qui, descriviamo un metodo per isolare i roditori le cellule fetali del polmone di tipo II epiteliali e fibroblasti e di esporle alla stimolazione meccanica con...

Un sistema sperimentale per studiare meccanotrasduzione in cellule polmonari fetali

Vi presentiamo un mouse fetale sistema di coltura in vitro eritroblasto fegato che analizza le fasi precoce e tardiva dell'eritropoiesi terminale. Questo sistema facilita l'analisi funzionale di geni specifici in diversi stadi di sviluppo.

Mouse fetale Fegato Cultura di sistema per sezionare Funzioni gene bersaglio nelle fasi precoci e tardivi del Terminal eritropoiesi

L'uso di topi reporter accoppiati a tutto il monte e sezione colorazione, microscopia e in vivo facilita l'analisi dei meccanismi alla base della normale patterning del tratto respiratorio. Qui si descrive come queste tecniche hanno contribuito all'analisi di segnalazione Wnt durante lo sviluppo tracheale.

Studiare Wnt segnalazione Durante Patterning di condurre Airways

Questo protocollo dirige in modo efficiente topo staminali embrionali derivato dalle cellule endoderma definitivo per maturare delle vie aeree cellule epiteliali. Questa tecnica utilizza differenziazione 3-dimensionale impalcature polmone decellularized di indirizzare specifiche lignaggio del polmone, in un ambiente culturale privo di siero definito.

Generazione di cellule di topo Airway epiteliali ESC-derivati ​​dall&#39;uso di decellularized Lung Ponteggi

L'articolo descrive la differenziazione diretta graduale delle cellule staminali pluripotenti indotte in organoidi polmonari interi tridimensionali contenenti cellule polmonari epiteliali sia prossimali che distali insieme a mesenchima.

Generazione di organoidi polmonari interi 3D da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare

Il protocollo descrive un bioreattore abilitato all'imaging che consente la rimozione selettiva dell'epitelio endogeno dalla trachea di ratto e la distribuzione omogenea di cellule esogene sulla superficie del lume, seguita da una coltura in vitro a lungo termine del costrutto cellula-tessuto.

Bioreattore guidato da imaging per la generazione di tessuto delle vie aeree bioingegnerizzato

Il protocollo presenta un metodo per derivare organoidi polmonari umani da tessuti polmonari primari, espandere gli organoidi polmonari e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi delle vie aeree 3D e 2D che fenocopio fedelmente l'epitelio delle vie aeree umane.

Stabilire organoidi polmonari umani e differenziazione prossimale per generare organoidi maturi delle vie aeree

Qui, descriviamo un protocollo semplice ed economico per eseguire una quantificazione imparziale della densità microvascolare polmonare per il tessuto polmonare di topi interi utilizzando una singola colorazione dell'isolectina B4.

Quantificazione della densità microvascolare polmonare nei topi attraverso i lobuli

In questo rapporto si descrive un metodo per l'isolamento e la coltura della nicchia delle cellule progenitrici dal rene embrionali di topo che può essere utilizzato per studiare vie di segnalazione che regolano staminali / progenitrici delle cellule del rene di sviluppo. Queste cellule in coltura sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ​​ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che consente la manipolazione efficiente di percorsi candidato.

Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo

Scopri la coltura di polmoni embrionali di topo per studiare le interazioni epitelio-mesenchimali e la morfogenesi polmonare. Questo metodo permette di osservare la crescita e il branching in risposta a trattamenti specifici.

Embrionali di topo Cultura Lung, un sistema per valutare i meccanismi molecolari della Branching

Esplora altri video