Preparazione del virion del poliomavirus a cellule di Merkel ricombinante (MCPyV): una tecnica per produrre virion MCPyV ricombinante ad alto titolo

- Il poliomavirus a cellule di Merkel, o MCPyV, è un oncovirus a DNA a doppio filamento con un genoma circolare che causa il carcinoma a cellule di Merkel, un tipo di cancro della pelle. Per preparare i virioni MCPyV, in primo luogo, trattare una coltura aderente di cellule di imballaggio con un cocktail contenente un agente di trasfezione, il genoma virale e due plasmidi di espressione che codificano le proteine necessarie per promuovere la replicazione virale.

Durante l'incubazione, il reagente di trasfezione forma lipoplex con i plasmidi, facilitando la loro consegna nelle cellule di confezionamento. Una volta all'interno del nucleo, il macchinario cellulare permette l'espressione dei genomi virali e plasmidici. I plasmidi di espressione codificano per l'antigene dei grandi tumori e per le proteine dell'antigene dei piccoli tumori. Queste proteine traslocano nel nucleo e guidano la replicazione del DNA virale. Successivamente, il genoma virale codifica per le proteine strutturali del capside. Queste proteine si spostano nel nucleo e aiutano nell'assemblaggio dei virioni ricombinanti.

Quindi, raccogli le cellule in coltura. Trattarli con una soluzione contenente detersivo e DNasi. Il detersivo lisa le cellule per rilasciare i virus. La DNasi degrada qualsiasi DNA plasmidico libero dalla sospensione. Centrifuga per separare i detriti cellulari nel pellet. Caricare il surnatante contenente il virus in una provetta contenente un mezzo di gradiente di densità adeguato. Centrifuga per ottenere frazioni concentrate ricche di virione all'interno del mezzo di gradiente.

Nel seguente protocollo, mostreremo la preparazione di virioni MCPyV ricombinanti ad alto titolo utilizzando cellule 293TT.

- Nel tardo pomeriggio o alla sera, seminare 6 milioni di cellule 293TT-28 in un piatto di 10 centimetri contenente terreno DMEM integrato. Incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. La mattina successiva, assicurati che le celle siano confluenti per circa il 50%. Quindi, trasfettare le cellule con 66 microlitri di reagente di trasfezione, 12 microgrammi di RNA R17b isolato MCPyV relegato, 8,4 microgrammi di plasmide di espressione ST pMtB e 9,6 microgrammi di plasmide di espressione LT pADL. Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Il giorno seguente, quando le cellule trasfettate sono quasi confluenti, tripsinizzare le cellule e trasferirle in una piastra di 15 centimetri per un'espansione continua. Quando quel piatto diventa quasi confluente, trasferisci le cellule in tre nuovi piatti da 15 centimetri. Quando questi nuovi piatti diventano quasi confluenti, raccogli le cellule come indicato nel protocollo di testo. Centrifugare a 180 x g a temperatura ambiente per 5 minuti. Quindi, rimuovere il surnatante e aggiungere 1 volume cellulare di DPBS-Mg.

Aggiungere 25 micromolari di solfato di ammonio, seguiti da Triton X-100 allo 0,5%, benzonasi allo 0,1% e DNasi ATP-dipendente allo 0,1%. Mescolare bene e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, raffreddare il composto con ghiaccio per 15 minuti. Quindi, aggiungi 0,17 volumi di cloruro di sodio. Mescolare e incubare con ghiaccio per altri 15 minuti. Centrifugare a 12000 x g a 4 gradi Celsius per 10 minuti. Se il surnatante non è limpido, capovolgere delicatamente la provetta e ripetere la centrifugazione.

Successivamente, trasferire il surnatante in una nuova provetta. Risospendere il pellet in un volume di DBPS integrato con 0,8 moli di cloruro di sodio. Centrifugare a 12000 x g a 4 gradi Celsius per 10 minuti. Se il surnatante non è limpido, capovolgere delicatamente la provetta e ripetere la centrifugazione. Unire i due surnatanti e centrifugare nuovamente a 12000 x g a 4 gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi, utilizzare una pipetta per depositare i gradienti di iodioxonale in provette di poliallomero da 5 millilitri a parete sottile, come indicato nel protocollo di testo. Caricare 3 millilitri del surnatante chiarificato contenente virus sopra il gradiente iodioxonale preparato. Centrifugare con un rotore SW55ti a 234.000 x g e a 16 gradi Celsius per 3,5 ore, assicurandosi di impostare l'accelerazione e la decelerazione su un rallentamento. Al termine dell'ultracentrifugazione, raccogliere 12 frazioni in provette siliconate.