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0 visualizzazioni • 3:45 min • April 30th, 2023
- I fattori di trascrizione sono proteine contenenti domini leganti il DNA. Si legano a specifiche sequenze di DNA e aiutano a regolare l'espressione genica nelle cellule. Per rilevare l'espressione del fattore di trascrizione nei melanociti associati alla squama, in primo luogo, raccogliere squame dorsali pigmentate scure da un pesce zebra anestetizzato. Fissare le squame e trattarle con una soluzione di permeabilizzazione per rendere permeabili i singoli melanociti.
Trattare con una soluzione di candeggina per rimuovere i granuli di pigmento di melanina scura dalle cellule. Questo processo di sbiancamento elimina la possibilità di segnali di fondo associati al pigmento durante le successive fasi di colorazione. Incubare con una soluzione bloccante contenente proteine per bloccare i siti di legame proteico non specifici sulla superficie cellulare.
Ora, trattare il campione con gli anticorpi primari desiderati. Questi anticorpi si legano ai loro fattori di trascrizione bersaglio all'interno delle cellule. Quindi, etichettare il campione con anticorpi secondari marcati con fluorescenza specifici per gli anticorpi primari. Inoltre, trattare il campione con un colorante legante il DNA fluorescente appropriato per colorare i nuclei cellulari. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per rilevare le emissioni fluorescenti luminose dai complessi fattore di trascrizione-anticorpo e dai nuclei cellulari.
Nel seguente protocollo, mostreremo l'immunocolorazione dei melanociti associati alla squama dorsale che esprimono il fattore di trascrizione induttore di melanociti-A, o mitfa, in un pesce zebra transgenico.
- Per eseguire l'immunocolorazione, anestetizzare il pesce in 0,17 milligrammi per millilitro di tricaina. Con la luce incidente al microscopio da dissezione, utilizzare una pinza affilata a punta fine per strappare le squame dorsali, facendo attenzione a non danneggiare la metà contenente melanociti della squama. Posizionare le squame direttamente dalla pinza in 1 millilitro di fissativo e incubare a temperatura ambiente, girando, per un tempo maggiore o uguale a 2 ore. Trasferisci il pesce nell'acqua del pesce e monitora il pesce per confermare il successo del recupero.
Per decolorare i melanociti pigmentati, per prima cosa, lavare due volte le squame fisse in PBST per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungi 1 millilitro di soluzione di candeggina appena fatta e copri con parafilm o tappi per evitare che il gas apra i tubi. Continua a decolorare fino a quando il pigmento non è sparito. Quindi, lavare in PBST quattro volte per 5 minuti a temperatura ambiente.
Incubare per almeno 30 minuti in soluzione a blocchi. Quindi, incubare con circa 400 microlitri di anticorpi primari in soluzione a blocchi per una notte a temperatura ambiente. Il giorno seguente, lavare la bilancia tre volte per 30 minuti in PBST a temperatura ambiente. Incubare con anticorpi secondari per 2 ore o tutta la notte a temperatura ambiente.
Dopo aver colorato con DAPI, applicare una goccia di vectashield su un vetrino e montare le squame in modo che il lato concavo delle squame sia rivolto verso il basso contro il vetrino. Posizionare un vetrino coprioggetto sui campioni. Usa lo smalto trasparente per sigillare i bordi e osserva i vetrini al microscopio a fluorescenza.