Saggio di trapianto sottocutaneo: un metodo per trapiantare cellule di melanoma da un donatore a un modello di pesce zebra ricevente

- Durante il test di trapianto di melanoma, le cellule cancerose di zebrafish portatrici di tumore vengono trapiantate in un modello ricevente immunocompromesso per studiare lo sviluppo del tumore. Inizia prendendo un pesce zebra donatore tumorale soppresso e reseca chirurgicamente il tumore dal suo corpo. Trasferire il tumore in una capsula di Petri contenente un tampone adatto e tritarlo in piccoli pezzi.

Successivamente, triturare i frammenti tumorali utilizzando una pipetta. Questo dissocia i pezzi tumorali in singole cellule. Ora, caricare la sospensione delle cellule tumorali in una siringa. Successivamente, prepara un pesce zebra Casper ricevente immunocompromesso su una carta da filtro. Questa variante mutante del pesce zebra, carente di pigmentazione, è priva di melanociti e iridofori, il che la rende trasparente e versatile per esperimenti di imaging e trapianto.

Successivamente, iniettare la sospensione di cellule di melanoma precaricata per via sottocutanea nella regione sopra la cavità peritoneale, a metà strada tra il rombencefalo e la pinna dorsale del pesce zebra di Casper. Ora, trasferisci il pesce ricevente nell'acqua e monitoralo per osservare lo sviluppo del tumore. Il corpo trasparente del pesce zebra aiuta nella facile visualizzazione dei tumori sviluppati.

Nel seguente protocollo, mostreremo il trapianto di cellule di melanoma da un donatore di pesce zebra portatore di tumore transgenico a un modello di pesce Casper ricevente immunocompromesso.

- Dopo aver irradiato un pesce Casper ricevente di 2 o 3 mesi con 25 Gy di irradiazione gamma un giorno prima del trapianto, lasciare che il pesce si riprenda in acqua. Usa la tricaina per sopprimere un pesce portatore di tumore. Tagliare il tumore e metterlo in una capsula di Petri con circa 5 millilitri di filtro sterilizzato 0,9x PBS con il 5% di FPS. Con un rasoio, taglia a dadini il tumore mentre è in soluzione.

Lavorando a temperatura ambiente e con una pipetta P1000, triturare per produrre singole cellule. Aumentare il volume a 25 millilitri. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a maglie da 40 micrometri e centrifugare in una centrifuga da tavolo a 453 rcf per 10 minuti. Risospendere il pellet in 0,9% PBS 5% FBS alla concentrazione desiderata.

Utilizzando un emocitometro, calcolare il numero esatto di cellule e diluire la sospensione cellulare in modo che il volume finale di iniezione sia di circa 5 microlitri. Ad esempio, se devono essere iniettate 50.000 cellule, la sospensione cellulare deve essere diluita fino a una concentrazione finale di 10.000 cellule per microlitro. Agitare il tubo contenente la sospensione cellulare ogni pochi minuti per evitare la formazione di grumi sulle cellule.

Con etanolo al 100% e PBS 0,9x, lavare una siringa Hamilton da 201 microlitri 701 N 10 microlitri calibro 26s (punta smussata) da 2 a 3 volte prima di caricare la siringa con 5 microlitri di sospensione cellulare. Dopo aver anestetizzato il pesce ricevente irradiato in tricaina, posizionarlo su un lato su un Kimwipe umido.

Stabilizzare il pesce con una mano e inserire l'ago con lo smusso rivolto verso l'alto con un angolo di 45 gradi nel fianco del pesce sopra la cavità peritoneale a circa metà strada tra il limite posteriore del rombencefalo e il bordo interno della pinna dorsale. Premere delicatamente lo stantuffo. Lasciare che il pesce si riprenda in acqua fresca e osservare quotidianamente il pesce per l'attecchimento del tumore. Se si è verificato un attecchimento, si può osservare anche una crescita continua e lo sviluppo della malattia.