Name: Registrazione Comportamento multicellulari in Myxococcus xanthus Biofilm utilizzando Time-lapse microcinematografia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Scopri la microcinematografia time-lapse per studiare il comportamento multicellulare di Myxococcus xanthus. Questo metodo economico utilizza guarnizioni in silicone riutilizzabili per ottenere risultati riproducibili e quantificabili.

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Questa ricerca è stata resa possibile da una carriera premio National Science Foundation (MCB-0746066, Caratterizzazione di attivatori trascrizionali che regolano il comportamento emergente) per RDW Siamo grati a LJ Shimkus, BS Goldman, G. Suen, M. Singer, LG Welch, KA Murphy, e HG Taylor per utili discussioni e commenti sul manoscritto.

Forniture necessarie: <ul><li> Klett metro </li><li> Pipetta e suggerimenti </li><li> Microprovette 2,5 ml </li><li> Microcentrifuga </li><li> CTTYE media: <ul><li> 1,0% Casitone (Laboratori Difco), estratto di lievito 0,5% (Difco Laboratories), </li><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8.0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> TPM media: <ul><li> 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8.0 mM MgSO 4 </li></ul></li><li> Agarosio </li><li> Bagnomaria regolato a 55 ° C </li><li> Vetrini per microscopio </li><li> Coprioggetto di vetro di grandi dimensioni </li><li> 2 x 2 cm, 0.5 mm di spessore guarnizione in gomma di silicone (Grazia Bio-Lab Inc.) </li><li> Parafilm (o nastro etichettatura) </li><li> Forcipe </li><li> Clip legante piccoli </li><li> Micro-campionamento pipetta (Fisher) </li><li> 100 microlitri punta di vetro monouso (Fisher) </li><li> Kimwipes </li></ul> Parte 1: Preparazione cellulare Iniziamo creando un ambiente sterile. <ul><li> Pulire lavoro, indossare guanti, e bruciatore luce. </li></ul><ol><li> Avviare una cultura durante la notte di cellule da inoculare in un pallone contenente brodo CTTYE e incubate al buio a 32 ° C, rimestando vigoroso. </li><li> Una volta che la cultura ha raggiunto una densità di 5 x 10 8 cellule / ml, pipetta da 1 ml di cellule in una provetta 2,5 ml. </li><li> Celle a pellet per centrifugazione per 2 minuti a 16.000 xg (o la velocità max). </li><li> Decantare il surnatante e gettarlo. </li><li> Lavare il pellet con 1 ml di TPM (sale-bilanciato, nutriente senza media). <ul><li> risospendere e vortice </li></ul></li><li> Re-pellet cellule facendo girare per 2 minuti a 16.000 xg (o la velocità max). </li><li> Decantare il surnatante e gettarlo. PUNTO CRITICO </li><li> Completamente risospendere pellet in 100 mezzi TPM microlitri utilizzando una combinazione di pipettaggio e vortex. IMPORTANTE: Questo passaggio garantisce che non ci siano grumi di cellule sinistra nel tubo. Questa operazione potrebbe richiedere un po '. </li><li> Impostare le celle da parte a temperatura ambiente durante la preparazione delle piastre test di monitoraggio. </li></ol> Parte 2: Preparazione Agar <ol><li> Preparare 50 ml di entrambi i TPM (saggio di media) e CTTYE (disco nutritivo) dei media. </li><li> Aggiungere 0,5 g di agarosio ad ogni (agarosio è meno diffrazione di agar). </li><li> Autoclave per la sterilizzazione. </li><li> Dopo la sterilizzazione, mantenere i media a 55 ° C in un incubatore (o bagnomaria), mentre la costruzione del monitoraggio complessi micropiastra. </li></ol> Parte 3: Costruzione del disco Nutritive <ol><li> Inserire una sterile 0,5 mm di spessore guarnizione in gomma siliconica sulla cima di una fiamma sterilizzato vetrino microscopio, formando un piccolo pozzo. </li><li> Pipettare ~ 300 microlitri della 55 ° C CTTYE media / agarosio nel pozzo creato dalla guarnizione della diapositiva e contenente il disco nutritive. I media CTTYE / agarosio deve tumulo alto. </li><li> Posizionare un vetrino sterilizzato fiamma (senza guarnizione) sulla parte superiore del supporto CTTYE / agarosio. IMPORTANTE: Questa diapositive devono essere stabilite con un angolo per evitare la formazione di bolle. </li><li> Una volta che la diapositiva è a posto, bloccare il complesso insieme legante mini clip - uno su ciascun lato. </li><li> Posizionare il complesso tagliato a 4 ° C e lasciare i media CTTYE / agarosio da impostare. Questo richiede di solito circa 5 min. </li></ol> Parte 4: Preparazione del saggio di monitoraggio - Set Up Complessi Piastra Assemblare i componenti, preparare i complessi di diapositive, posizionare il disco nutritive, versare i media TPM / agarosio, complessi piastra separata e secco, le cellule piatto, e assemblare il monitoraggio complessi micropiastra. Assemblare componenti piastra complessi <ol><li> Per ogni complesso, fiamma sterilizzato un vetrino per microscopio </li><li> Posizionare una guarnizione in autoclave sulla parte superiore del vetrino e mettere da parte (sterilizzato verso l'alto). Ciò costituirà la base del test. </li><li> Fiamma sterilizzare una copertura in vetro antiscivolo e posizionarlo in cima ad una seconda diapositiva microscopio vetro avvolto con nastro etichettatura (o Parafilm) e mettere da parte (sterilizzato verso l'alto). Questo viene utilizzato come una diapositiva supporto per mantenere le coprioggetto di cracking. Questa sarà la parte superiore del test. </li><li> Sterilizzate terzo vetrino da microscopio in vetro e mettere da parte (sterilizzato verso l'alto). Questo sarà usato per appiattire l'agarosio. IMPORTANTE: Assicurarsi che le guarnizioni forma un sigillo con il vetro premendolo verso il basso con pinza, altrimenti la media / agarosio potrebbe seccare. </li></ol> P pizzo disco nutritive IMPORTANTE: passaggi da 5 a 10 deve essere fatto per un complesso diapositiva alla volta, altrimenti i media / agarosio potrebbe iniziare a solidificare con conseguente scarsa qualità del film. <ol start="5"><li> Rimuovere il modulo nutritive disco complesso 4 ° C (passo 5 da parte 3) e indagare separatamente le diapositive esporre l'ormai solidificato CTTYE / agarosio. </li><li> Rimuovere un 1 'disco nutritivi' mm di diametro dai media CTTYE / agarosio ben descritta sopra utilizzando una micro-pipetta di campionamento con una punta di 100 microlitri bicchiere usa e getta e metterla nel pozzo creata dalla guarnizione sul vetrino (punto 3) . </li></ol> Versare nelle piastre PUNTO CRITICO <ol start="7"><li> Pipettare ~ 300 microlitri della 55 ° C TPM media / agarosio nel pozzo creato dalla guarnizione sul vetrino e contenente il disco nutritive. I media TPM / agarosio deve tumulo alto. PUNTO CRITICO </li><li> Posizionare il vetrino fiamma sterilizzato senza guarnizione (dal punto 3) sulla parte superiore del supporto TPM / agarosio. IMPORTANTE: Questa diapositive devono essere stabilite con un angolo per evitare la formazione di bolle. </li><li> Una volta che la diapositiva (dal punto 5) è in posizione, bloccare il complesso insieme legante mini clip - uno su ciascun lato. </li><li> Posizionare il complesso tagliato a 4 ° C e lasciare i mezzi di comunicazione / agarosio da impostare. Questo richiede di solito circa 5 min. </li></ol> Lastre separate e asciutto IMPORTANTE: per evitare che i media / agarosio si secchi, i passaggi da 11 a 20 deve essere eseguita solo su un complesso diapositiva alla volta. IMPORTANTE: Per ottenere i migliori risultati, i passaggi da 11 a 13 deve essere eseguita a 4 ° C. <ol start="11"><li> Una volta che i media / agarosio ha creato, rimuovere la clip legante e spremere la fine del complesso per allentare il nastro avvolto diapositive. </li><li> Rimuovere il nastro avvolto diapositive e metterlo in panchina per un ulteriore uso. PUNTO CRITICO </li><li> Utilizzando pinze come un cuneo, separare la polizza di copertura / guarnizione / media / agarosio complesso dalla diapositiva di supporto (senza guarnizione) e scartare scivolo supporto. IMPORTANTE: Non usare un movimento indiscreti per separare la polizza di copertura / complesso guarnizione. Questo potrebbe causare la rottura slittamento copertura e / o il media / agarosio attenersi alla diapositiva supporto. </li><li> Collocare il vetrino / guarnizione / media / agarosio complesso sul nastro avvolto scivolo (lato guarnizione in su) e togliere dal 4 ° C. Inserire questo accanto ad un complesso bruciatore per permettere a tutti evaporare l'umidità visibile dalla recente esposizione media / agarosio superficie - non più di 1 min. IMPORTANTE: Non lasciare che la media / agarosio a secco per troppo tempo in quanto ciò potrebbe influire il M. xanthus sciame comportamento. </li></ol> Piastra di cellule PUNTO CRITICO <ol><li> Una volta che l'umidità in eccesso è evaporata, pipettare 0,5 l di cellule concentrate (punto 8 da parte 1) sul supporto / agarosio circa 1 mm di distanza dal disco di nutrienti. IMPORTANTE: E 'estremamente importante assicurarsi che le cellule si depositano spostando la pipetta verso il basso e poi verso l'alto. Questo assicura che lo sciame sarà circolare. IMPORTANTE: E 'estremamente importante non toccare la punta della pipetta ai media / agarosio. Questo farà una depressione sulla superficie e cambiare il comportamento del M. xanthus sciame. SUGGERIMENTO: Premere la punta della pipetta prima di avvicinarsi ai media / agarosio. Questo permetterà una goccia di cellule ad apparire sul fondo la punta della pipetta e rendere più facile per depositare le cellule. </li><li> Una volta che le cellule sono depositate, luogo il prossimo complesso al bruciatore per consentire lo spot cellulare a secco - non più di 20 sec. </li></ol> Assemblare test <ol><li> Una volta che lo spot cellulare si è asciugato, allineare la diapositiva / guarnizione complesso (dal punto 1) con la guarnizione sul vetrino / guarnizione / media / agarosio / cellulari complessi (dal punto 13) e premere delicatamente insieme per formare un sigillo. PUNTO CRITICO </li><li> Pulire le superfici del vetrino e coprire scivolare con un Kimwipe per rimuovere i residui lasciati dai Parafilm. Il test completato dovrebbe essere simile a Figura 1. </li><li> Posizionare il complesso scivolo completato la fase di riscaldamento mantenuta a 32 ° C (scivolare verso il basso, coprire scivolare verso l'alto) subito dopo pulire (passo 15) per evitare che forma la formazione di condensa. In caso di formazione di condensa, lasciare riposare complesso scivolare sul palco riscaldato per alcuni secondi prima di avviare il software di acquisizione immagini. </li><li> Scegli l'obiettivo appropriato (2X, 4X o 10X). </li></ol> Parte 5: Preparazione del film t "&gt; PUNTO CRITICO <ol><li> Accendere la fotocamera e il microscopio, e controllare i livelli di luce (assicuratevi che la luce non è troppo intenso). Avviare il computer e aprire il programma di acquisizione delle immagini. </li><li> Fare clic sulla finestra dell'immagine dal vivo e mettere a fuoco il microscopio. L'immagine dovrebbe essere simile a quello visto in Figura 3. Si noti la superficie uniforme agar. </li><li> Avviare l'acquisizione di immagini. PUNTO CRITICO </li><li> Controllare regolarmente la messa a fuoco durante la prima ora, come i media / agar tende a sedimentare causando la messa a fuoco ad andare alla deriva. </li><li> Pulire l'area di lavoro. </li><li> Una volta che l'acquisizione delle immagini è completa, il trasferimento delle immagini acquisite per la conservazione e abbattere il complesso diapositiva immersione in etanolo al 90% durante la notte. </li><li> Guarnizioni autoclave per il riutilizzo. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Cartoon illustrazione del complesso piastra TM. (A) mostra la piastra di base complesso TM in vista esplosa e sezione. (B) mostra l'uso di grandi guarnizioni. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Grappolo microscopio. Ogni nodo microscopio (nel riquadro) è costituito da un microscopio Nikon E400, obiettivi, uno stadio riscaldato, una fotocamera Insight, e un computer portatile. Ogni nodo è in rete tra loro e collegati ad un computer master controller. Due i nodi sono configurati con capacità di fluorescenza che consistono della sorgente di luce EXFO e due ante Uniblitz. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Un 20X immagine di apparati di analisi di tracciamento al tempo = 0. Scala grafica, 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Adattabilità del complesso piastra TM. (A) una immagine 100X di M. xanthus scivolando sulla motilità CTTYE a 1,0% agar. (B) un 20X l'immagine di P. aeruginosa spasmi motilità. (C) un 20X immagine S. marcescens brulicante motilità. Entrambi (B) e (C) sono stati analizzati con LB nel 1,0% agar. (D) una immagine 40X di M. smegmatis scorrevole motilità su LB nello 0,5% agar. Questa immagine è stata scattata con la configurazione alternativa test visto in Fig. 1B. Video 1. Un time-lapse video di uno sciame sottoposto al test di rilevamento. Video 2. Un time-lapse video di un M. xanthus sciame dove 1% delle cellule sono marcate. Alternando immagini a contrasto di fase e fluorescenti sono stati catturati e sovrapposti per chiarire la posizione delle cellule fluorescenti all'interno dello sciame. Questo video è stato catturato il CTTYE a 1,0% agar. Video 3. Un time-lapse video di M. xanthus deltaplano motilità. Questo video è stato catturato il CTTYE a 1,0% agar. Video 4. Un time-lapse video di P. aeruginosa spasmi motilità. Questo video è stato catturato su LB nel 1,0% agar. Video 5. Un time-lapse video di S. marcescens brulicante motilità. Questo video è stato catturato su LB nel 1,0% agar. Video 6. Un time-lapse video di M. smegmatis scorrevole motilità. Questo video è stato catturato su LB nello 0,5% agar utilizzando la configurazione alternativa test visto in Fig. 1B.

<ol><li>Taylor, R. G., Welch, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+as+an+emergent+property+of+a+swarm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis as an emergent property of a swarm.</a> J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).</li>
<li>Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Myxococcus+xanthus+During+Fruiting+Body+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation.</a> J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).</li>
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<li>Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+surface+migration%2C+and+other+dynamic+behavior+in+bacterial+biofilms+revealed+by+digital+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging.</a> Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).</li>
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<li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li>
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<li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li>
<li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li>
<li>Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Time-lapse microcinematografia (TM) è diventato un approccio standard allo studio della motilità procarioti 2-7. Tradizionalmente, TM viene eseguita utilizzando stoppini carta da filtro, pastiglie agar sottile, o lastre di agar come substrati 8-11. Questi metodi sono adeguati ed economicamente efficace quando usata per generare sequenze di immagini per le illustrazioni generale del movimento dei batteri. Tuttavia, se le sequenze di immagini deve comportare la generazione di dati riproducibili e qua...

<table><tbody><tr><td>1,0% Casitone</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5% estratto di lievito</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta per microcampionamento</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punta di vetro monouso da 100 &amp;mu;l</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione in gomma siliconica da 2 x 2 cm, spessa 0,5 mm</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

registrazione comportamento multicellulari in myxococcus xanthus biofilm utilizzando time-lapse microcinematografia

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Uno sciame di δ-proteobacterium Myxococcus xanthus contiene milioni di cellule che agiscono come un collettivo, il movimento coordinamento attraverso una serie di segnali per creare complessi, i modelli dinamici come risposta a stimoli ambientali. Questi modelli sono auto-organizzazione ed emergenti, non può essere previsto osservando il comportamento delle singole celle. Utilizzando un time-lapse analisi monitoraggio microcinematografia, abbiamo identificato un modello distinto emergente in M. xanthus chiamato chemiotassi, definito come il movimento diretto di uno sciame di un gradiente di nutrienti verso la sua sorgente 1. Al fine di caratterizzare in modo efficiente chemiotassi tramite time-lapse microcinematografia, abbiamo sviluppato un piatto altamente modificabile complesso (Figura 1) e costruito un cluster di 8 microscopi (Figura 2), ciascuno in grado di catturare video time-lapse. Il test è sufficientemente rigorosa per consentire la replicazione coerente di dati quantificabili, e il video risultante ci permettono di osservare e tracciare i cambiamenti sottili nel comportamento sciame. Una volta catturati, i video vengono trasferiti ad una analisi / storage computer con memoria sufficiente per elaborare e memorizzare migliaia di video. La flessibilità di questa configurazione è dimostrato utile a diversi membri della M. xanthus comunità.

Per studiare<em&gt; Myxococcus xanthus</em&gt; Comportamento sciame, abbiamo progettato un time-lapse protocollo microcinematografia che possono essere modificati per saggi differenti. Impiega le condizioni di crescita standard adattate per la microscopia, e produce risultati riproducibili con l&#39;uso di poco costoso, guarnizioni in silicone riutilizzabile. Abbiamo usato questo metodo per quantificare chemiotassi pluricellulari.

Registrazione Comportamento multicellulari in Myxococcus xanthus Biofilm utilizzando Time-lapse microcinematografia

Uno sciame del $\delta$-proteobatterio Myxococcus xanthus contiene milioni di cellule che agiscono come un collettivo, coordinando il movimento attraverso una serie di...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sviluppare un saggio di microcinematografia in time-lapse economico, ma sufficientemente rigoroso da produrre risultati riproducibili e quantificabili. Questo risultato si ottiene utilizzando guarnizioni di silicone riutilizzabili e poco costose per costruire piastre con terreni agarizzati o vetrini per microscopio. I risultati ottenuti dimostrano che questi complessi di piastre rimangono idratati e sufficientemente ossigenati per oltre una settimana, in diversi tipi di terreno e concentrazioni di agar.Inoltre, poiché la microcinematografia in time-lapse è un processo lento, l'utilizzo di otto microscopi economici aiuta ad accelerare l'acquisizione dei dati. Ciao, sono Ryan Taylor del laboratorio del Dott. Roy Welch del Dipartimento di Biologia della Syracuse University. Oggi vi mostreremo una procedura per realizzare filmati in time-lapse di biofilm batterici nel nostro laboratorio; utilizzeremo questa procedura per studiare il comportamento multicellulare dei biofilm MTIs.Cominciamo. Per iniziare questa procedura, misurare la densità cellulare di una coltura notturna di Occus sanus con un clutometro, trasferire un millilitro della coltura in un tubo da centrifuga da 2,5 millilitri, centrifugare, lavare e risospendere i batteri nel mezzo TPM come descritto nel protocollo scritto allegato, pipettare e vortexare per risospendere completamente il pellet, operazione che potrebbe richiedere del tempo. Successivamente, aggiungere 0,5 grammi di aros a 50 millilitri di TPM, che costituisce il mezzo per il saggio.Aggiungere anche 0,5 grammi di aros a 50 millilitri di C-T-T-Y-E, che è il terreno di coltura in disco da sterilizzare in autoclave. Successivamente, mantenere il terreno a 55 gradi Celsius in un incubatore o bagno termico. Durante la preparazione del saggio di tracciamento.I complessi della piastra procedono alla costruzione del disco nutriente prima della sterilizzazione a fiamma del vetrino microscopico in vetro. Posizionare sul vetrino una guarnizione sterile in gomma siliconica spessa 0,5 millimetri. Pipettare circa 300 microlitri di mezzo C TT YE aros nel pozzetto creato dalla guarnizione sul vetrino.Il terreno solido C-T-T-Y-E deve essere riscaldato fino a incandescenza per sterilizzarlo; quindi sterilizzare un altro vetrino e appoggiarlo con un angolo rispetto al terreno solido C-T-T-Y-E. Posizionare il vetrino con un angolo evita la formazione di bolle. Una volta posizionato il vetrino, fissare l'insieme con due clip piccole, una per lato.Posizionare il complesso tagliato a quattro gradi Celsius e lasciare solidificare l'agaro nel mezzo C-T-T-Y-E. Questo processo richiede solitamente circa cinque minuti. Una volta che l'agaro si è solidificato, è possibile preparare i complessi di piastre utilizzati nel saggio di tracciamento.Iniziare preparando i vetrini per la costruzione dei complessi del saggio. Per ogni complesso, sterilizzare a fiamma due vetrini in vetro. Posizionare una guarnizione da autoclave su uno dei vetrini per formare la base del saggio.L'altro vetrino viene utilizzato per appiattire gli agros e come vetrino di supporto. La parte superiore del saggio è costituita da un coprioggetto. Avvolgere innanzitutto un vetrino in nastro adesivo per etichette, quindi sterilizzare il coprioggetto di vetro alla fiamma e posizionarlo sopra il vetrino avvolto e sterilizzato.Fare scorrere verso l'alto i supporti del vetrino avvolti per sostenere il coprioggetto, impedendo che si incrina. Posizionare una guarnizione per autoclave sopra il coprioggetto sterilizzato alla fiamma utilizzando pinzette. Premere verso il basso sulle guarnizioni del vetrino inferiore e sul coprioggetto per assicurarsi che formino una chiusura ermetica con il vetro.In caso contrario, i mezzi di coltura potrebbero seccarsi. Mettere da parte la guarnizione del vetrino e le guarnizioni del coprioggetto con le superfici sterili rivolte verso l'alto e, da questo momento in poi, lavorare su un solo complesso alla volta per evitare che gli agarosio nei mezzi di coltura solidifichino, il che comprometterebbe la qualità del filmato. Iniziare posizionando il disco nutritivo.Rimuovere il complesso del disco nutritivo da quattro gradi Celsius. Rimuovere l'eclissante e in precedenza separare i vetrini esponendo gli aros C-T-T-Y-E ormai solidificati utilizzando una pipetta micrometrica con una punta di vetro monouso da 100 microlitri. Prelevare un disco nutritivo di un millimetro di diametro dall'agar del mezzo C-T-T-Y-E e posizionarlo nella cavità creata dalla guarnizione sul vetrino coprioggetto.Quindi prelevare l'agar del mezzo TPM dall'incubatrice e pipettare 300 microlitri nel pozzetto creato dalla guarnizione sul vetrino, contenente il disco nutritivo. L'agar del mezzo TPM deve formare una piccola elevazione, in modo da appiattire l'agar del mezzo T-P-M-S-A. Posizionare uno dei vetrini sterilizzati alla fiamma, privi di guarnizione, in posizione inclinata sopra l'agar del mezzo TPM. Disporre il vetrino in posizione inclinata aiuta a prevenire la formazione di bolle d'aria.Stringere il complesso con graffette piccole, una su ciascun lato. Posizionare il complesso con le graffette a quattro gradi Celsius e lasciare solidificare il mezzo. Questo richiede solitamente circa cinque minuti.Una volta che il mezzo si è solidificato, rimuovere il complesso da quattro gradi Celsius. Rimuovere le clip di fissaggio e premere l'estremità del complesso. Per allentare il vetrino avvolto nel nastro, rimuovere il vetrino avvolto nel nastro e posizionarlo sul banco per un uso successivo.Quindi, utilizzando una pinzetta come cuneo, separare il complesso vetrino-coprioggetto-mezzo di tenuta agros dal vetrino di supporto e scartare il vetrino di supporto. Non utilizzare un movimento di leva per separare il complesso vetrino-coprioggetto-mezzo di tenuta, poiché ciò potrebbe causare la rottura del coprioggetto e/o l'adesione del mezzo di tenuta al vetrino di supporto.Dopo aver rimosso il vetrino di supporto, posizionare il complesso del dispositivo con camera di scorrimento contenente il mezzo di coltura sul vetrino avvolto nel nastro adesivo, con la guarnizione rivolta verso l'alto. Posizionare questo complesso accanto a un becco Bunsen per consentire l'evaporazione di tutta l'umidità visibile dalla superficie appena esposta dell'agar del mezzo di coltura. Non lasciare asciugare l'agar del mezzo di coltura per più di un minuto.Poiché ciò potrebbe influenzare il comportamento di nuvola di M Zant, procedere a piastrare le cellule sul complesso saggio appena preparato. Una volta che l'eccesso di umidità si è evaporato dal complesso di agarosio del tamponamento del vetrino, aspirare 0,5 microlitri delle cellule concentrate per depositarle sul mezzo. Aeros premere la punta della pipetta prima di avvicinarsi all'agarosio del mezzo.Una goccia di cellule appare alla base della punta della pipetta, facilitando il rilascio delle cellule senza che la punta tocchi l'agarosio. Una depressione sulla superficie dell'agarosio può modificare il comportamento dello swarm. Abbassare verticalmente la pipetta per dispensare le cellule a circa un millimetro di distanza dal disco nutritivo incorporato.Quindi estrarre la pipetta direttamente verso l'alto. In questo modo, si garantisce che lo strato batterico sia circolare. Una volta depositate le cellule, posizionare la piastra accanto al becco Bunsen per far asciugare il punto di inoculo per non più di 20 secondi.Dopo l'essiccazione, allineare l'insieme del guarnizione del vetrino che forma la parte inferiore del complesso con la guarnizione sul coperchio. Inserire il mezzo della guarnizione sopra il complesso cellulare acro che forma la parte superiore del complesso. Premere delicatamente insieme per formare una chiusura ermetica.Pulire le superfici del vetrino e del coprioggetto con un fazzoletto di carta kimwipe per rimuovere eventuali residui, al fine di prevenire la formazione di condensa. Posizionare il complesso sul portapreparati riscaldato del microscopio immediatamente dopo aver pulito i vetrini, con il vetrino rivolto verso il basso e il coprioggetto verso l'alto. Se si è formata della condensa, lasciare il complesso sul portapreparati riscaldato per alcuni secondi prima di avviare il software di acquisizione delle immagini.Per preparare il filmato, selezionare l'obiettivo appropriato, 2x, 4x o 10x, sul microscopio. Accendere la telecamera e il microscopio e verificare i livelli di luce per assicurarsi che non sia troppo intensa. Avviare il computer e aprire il programma di acquisizione delle immagini.Fare clic sulla finestra dell'immagine in tempo reale e mettere a fuoco il microscopio. L'immagine apparirà simile a quella mostrata qui. Iniziare ad acquisire le immagini.Assicurarsi di controllare regolarmente il fuoco durante la prima ora, poiché l'agar del mezzo tende a depositarsi causando uno spostamento del fuoco. Al termine dell'acquisizione delle immagini, trasferire le immagini acquisite per l'archiviazione. Smontare il complesso del vetrino immergendolo in etanolo al 90% per tutta la notte oppure utilizzare TOLA per pulire le guarnizioni e riutilizzarle.Questo filmato in time-lapse mostra em sottoposti al saggio di tracciamento descritto in questo articolo. La frequenza di acquisizione è di un'immagine al minuto con un ingrandimento di 20x; la velocità di riproduzione è di 60 immagini al secondo. Questo filmato in time-lapse mostra una popolazione di eant nelle cellule in cui l'1% delle cellule esprime GFP.Il filmato è stato assemblato unendo immagini alternate a contrasto di fase e immagini fluorescenti. Il saggio è stato eseguito su C-T-T-Y-E con un tasso di acquisizione di 1 immagine al minuto a un ingrandimento di 100 x. Questo filmato in time-lapse mostra la motilità strisciante di M Anthes.Questo saggio è stato eseguito su C-T-T-Y-E in Aros al 1%. La velocità di acquisizione è di un'immagine al minuto a un ingrandimento di 100 x. Questo filmato in TimeLapse mostra la motilità per contrazione di P OSA. Questo saggio è stato eseguito su LB in Aros al 1%. La velocità di acquisizione è di un'immagine al minuto.Con un ingrandimento di 20x, la velocità di riproduzione è di 60 immagini al secondo. Questo filmato in time-lapse mostra la motilità collettiva di Smar. Il saggio è stato eseguito su LB e agar all'1%, con una frequenza di acquisizione di un'immagine al minuto.Con un ingrandimento di 20x, la velocità di riproduzione è di 60 immagini al secondo. Questo filmato in time-lapse mostra la motilità scivolosa di EGT. Questo saggio è stato eseguito su LB con il 0,5% di Tag; la frequenza di acquisizione è di un'immagine al minuto, mentre con un ingrandimento di 20x la velocità di riproduzione è di 120 immagini al secondo a causa della fragilità del 0,5% di arose in lv.In questo saggio si utilizzano le guarnizioni più grandi mostrate nella figura uno B. Abbiamo appena mostrato come generare filmati in time-lapse di biofilm batterici. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di procedere con calma e di essere il più preciso possibile per ottenere risultati costanti.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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