Registrazione Comportamento multicellulari in Myxococcus xanthus Biofilm utilizzando Time-lapse microcinematografia

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di sviluppare un saggio di cinematografia micros time-lapse economico con sufficiente rigore per generare risultati riproducibili e quantificabili. Ciò si ottiene impiegando l'uso di guarnizioni in silicone riutilizzabili ed economiche per costruire piastre per terreni agricoli o vetrini per microscopio. Si ottengono risultati che mostrano che questi complessi di piastre rimangono idratati e sufficientemente ossigenati per più di una settimana su una varietà di tipi di terreni e concentrazioni di agar.

Inoltre, poiché la microcinematografia time-lapse è un processo lento, l'uso di otto microscopi economici aiuta ad accelerare l'acquisizione dei dati. Ciao, sono Ryan Taylor del laboratorio del Dr.Roy Welch del Dipartimento di Biologia dell'Università di Syracuse. Oggi vi mostreremo una procedura per realizzare filmati time-lapse di biofilm batterici nel nostro laboratorio, utilizzeremo questa procedura per studiare il comportamento multicellulare dei biofilm MTI.

Quindi iniziamo. Per iniziare questa procedura, misurare la densità cellulare di una miscela notturna di coltura Occus sanus con un glucometro, trasferire un millilitro di coltura in una provetta da centrifuga da 2,5 millilitri e risospendere i batteri in terreni TPM come descritto nel protocollo scritto allegato, pipettare e vortice per risospendere completamente il pellet, operazione che potrebbe richiedere del tempo. Quindi, aggiungere 0,5 grammi di aros a 50 millilitri di TPM, che è il terreno di analisi.

Aggiungere anche 0,5 grammi di aros a 50 millilitri di C-T-T-Y-E, che è il disco nutritivo autoclave per sterilizzare. Quindi mantenere il fluido a 55 gradi Celsius in un'incubatrice o in un bagno d'acqua. Durante la costruzione del saggio di tracciamento.

I complessi di piastre procedono alla costruzione del microscopio in vetro sterilizzatore a prima fiamma del disco nutritivo. Far scorrere e posizionare una guarnizione sterile in gomma siliconica spessa 0,5 millimetri sulla parte superiore del vetrino. Pipetta circa 300 microlitri di terreno C TT YE nel pozzetto creato dalla guarnizione sul vetrino.

Il C-T-T-Y-E media agro dovrebbe ammucchiare le fiamme, sterilizzare un altro vetrino e posizionarlo ad angolo sopra il C-T-T-Y-E media aros. Abbassando il carrello ad angolo si evita la formazione di bolle. Una volta che il vetrino è in posizione, rimpolpare il complesso insieme a mini clip per legante una su ciascun lato.

Posizionare il complesso tagliato a quattro gradi Celsius e lasciare che il media agro C-T-T-Y-E si solidifichi. Questo di solito richiede circa cinque minuti. Una volta impostato l'agro, si possono preparare i complessi di piastre utilizzati nel saggio di tracciamento.

Iniziare preparando i vetrini per la costruzione dei complessi di saggio. Per ogni complesso sterilizzato a fiamma due vetrini da microscopio in vetro. Posizionare una guarnizione per autoclave sulla parte superiore di uno dei vetrini per formare il fondo del saggio.

L'altra guida viene utilizzata per appiattire gli agro e come scivolo di supporto. La parte superiore del test è un vetrino coprioggetto. Per prima cosa avvolgere un vetrino da microscopio con nastro adesivo, quindi vetrino di vetro per sterilizzatore a fiamma e posizionarlo sopra il vetrino avvolto sterilizzato.

Far scorrere verso l'alto il vetrino avvolto supporta il vetrino coprioggetto, evitando che si rompa. Posizionare una guarnizione per autoclave sopra il vetrino coprioggetto sterilizzato a fiamma con una pinza. Premere sulle guarnizioni sul carrello inferiore e sul vetrino coprioggetto per assicurarsi che formino una tenuta con il vetro.

In caso contrario, gli array di supporti e supporti potrebbero seccarsi. Metti da parte i gruppi della guarnizione del vetrino scorrevole e del vetrino coprioggetto con i lati sterilizzati rivolti verso l'alto da qui in poi lavora solo su un complesso alla volta per evitare che gli agro del supporto si solidifichino, il che comporterebbe una scarsa qualità del film. Inizia posizionando il disco nutritivo.

Rimuovere il complesso del disco nutritivo a partire da quattro gradi Celsius. Rimuovere l'eclissi di legatura e la parte precedente dei vetrini che espongono gli aros C-T-T-Y-E ora solidificati utilizzando una pipetta per microcampionamento con un puntale monouso in vetro da 100 microlitri. Rimuovere anche un disco nutritivo di un millimetro di diametro dal media agro C-T-T-Y-E e posizionarlo nel pozzetto creato dalla guarnizione sul vetrino coprioggetti.

Quindi recuperare i terreni TPM dall'incubatore e pipettare 300 microlitri nel pozzetto creato dalla guarnizione sul vetrino di copertura e contenente il disco nutritivo. Il media TPM Agros deve ammucchiarsi fino ad appiattire il mezzo T-P-M-S-A aros Posizionare uno dei vetrini sterilizzati a fiamma senza guarnizione ad angolo sopra il media TPM aros. Posizionare il carrello ad angolo aiuta a prevenire la formazione di bolle.

Fissare il complesso insieme alle clip per mini leganti, una su ciascun lato. Posizionare il complesso ritagliato a quattro gradi Celsius e lasciare che il supporto si sia solidificato. Questo di solito richiede circa cinque minuti.

Una volta che il fluido si è solidificato, rimuovere il complesso da quattro gradi Celsius. Rimuovere le clip del raccoglitore e spremere l'estremità del complesso. Per allentare il vetrino avvolto nel nastro adesivo, rimuovere il vetrino avvolto nel nastro adesivo e posizionarlo sul banco per un ulteriore utilizzo.

Quindi usando un paio di pinze come cuneo. Separare il complesso agros della guarnizione del vetrino copricoperchio dalla slitta di supporto e gettare la slitta di supporto. Non utilizzare un movimento di leva per separare il complesso della guarnizione del vetrino coprioggetto poiché ciò potrebbe causare la rottura del vetrino coprioggetto e/o l'adesione del raggio del supporto al carrello di supporto.

Dopo aver rimosso la slitta di supporto, posizionare il supporto della guarnizione del vetrino copricoperchio sulla slitta avvolta nel nastro con il lato della guarnizione rivolto verso l'alto. Posizionare questo complesso vicino a un bruciatore per consentire a tutta l'umidità visibile di evaporare dalla superficie dell'agros del supporto appena esposta. Non lasciare asciugare i terreni agricoli per più di un minuto.

Poiché ciò potrebbe influire sul comportamento dello sciame di M Zant, procedere alla piastra delle cellule sul complesso del saggio appena preparato. Una volta che l'umidità in eccesso è evaporata dal complesso agros della guarnizione del vetrino, aspirare 0,5 microlitri delle celle concentrate per depositarle sul supporto. Gli aero premono la punta della pipetta prima di avvicinarsi ai terreni agricoli.

Una goccia di cellule appare nella parte inferiore del puntale della pipetta, facilitando il deposito delle cellule senza che il puntale tocchi il terreno. Una depressione sulla superficie dell'agros può cambiare il comportamento dello sciame mz. Spostare la pipetta verso il basso per erogare le cellule a circa un millimetro di distanza dal disco nutritivo incorporato.

Quindi tirare la pipetta verso l'alto. In questo modo, ci si assicura che lo sciame sia circolare. Una volta depositate le cellule, posizionare il complesso accanto al bruciatore per consentire alla macchia cellulare di asciugarsi per non più di 20 secondi.

Dopo l'asciugatura, allineare il gruppo della guarnizione scorrevole che forma il fondo del complesso con la guarnizione sul coperchio. Complesso di cellule acro della guarnizione di scorrimento che forma la parte superiore del complesso. Premere delicatamente insieme per formare un sigillo.

Pulire le superfici del vetrino coprioggetti con una salvietta per rimuovere eventuali residui al fine di prevenire la formazione di condensa. Posizionare il complesso sul tavolino riscaldato del microscopio subito dopo aver pulito i vetrini con il vetrino rivolto verso il basso e il vetrino di copertura verso l'alto. Se si è formata della condensa, lasciare riposare il complesso di diapositive sul tavolino riscaldato per alcuni secondi prima di avviare il software di acquisizione delle immagini.

Per preparare il filmato, scegliere l'obiettivo appropriato, due x quattro x o 10 x al microscopio. Accendi la fotocamera e il microscopio e controlla i livelli di luce per assicurarti che la luce non sia troppo intensa. Avviare il computer e aprire il programma di acquisizione delle immagini.

Fare clic sulla finestra dell'immagine dal vivo e mettere a fuoco il microscopio. L'immagine appare simile a quella mostrata qui. Inizia ad acquisire immagini.

Assicurati di controllare regolarmente la messa a fuoco durante la prima ora, poiché l'agar del terreno tende a depositarsi causando la deriva della messa a fuoco. Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, trasferire le immagini acquisite per l'archiviazione. Scomporre il complesso di scivoli immergendolo in etanolo al 90% per una notte o TOLA le guarnizioni per il riutilizzo.

Questo filmato in time lapse li mostra sottoposti al saggio di tracciamento qui descritto. La velocità di acquisizione è di un'immagine al minuto con un ingrandimento di 20 volte la velocità di riproduzione è di 60 immagini al secondo. Questo filmato time lapse mostra una popolazione di cellule in cui l'1% delle cellule esprime GFP.

Il filmato è stato compilato fondendo immagini a contrasto di fase alternate e fluorescenti. Il test è stato eseguito su C-T-T-Y-E con una velocità di acquisizione dell'1%Aros è di un'immagine al minuto con un ingrandimento di 100 x. Questo filmato time-lapse mostra la motilità planante di M Anthes.

Questo test è stato eseguito su C-T-T-Y-E con una velocità di acquisizione dell'1%Aros è di un'immagine al minuto con un ingrandimento di 100 x. Questo filmato TimeLapse mostra la motilità delle contrazioni di P OSA. Questo test è stato eseguito su LB in 1%La velocità di acquisizione di Aros è di un'immagine al minuto.

Con un ingrandimento di 20x, la velocità di riproduzione è di 60 immagini al secondo. Questo filmato in time lapse mostra Smar che percepisce la motilità brulicante. Questo test è stato eseguito su LB e la velocità di acquisizione dell'1% di Aris è di un'immagine al minuto.

Con un ingrandimento di 20x, la velocità di riproduzione è di 60 immagini al secondo. Questo filmato time lapse mostra la motilità di scorrimento EGT. Questo test è stato eseguito su LB in 0,5%La velocità di acquisizione della rosa è di un'immagine al minuto poiché un ingrandimento di 20 x la velocità di riproduzione è di 120 immagini al secondo a causa della fragilità dello 0,5% in lv.

Questo test impiega l'uso delle guarnizioni più grandi viste nella figura uno B. Abbiamo appena mostrato come generare filmati time-lapse di biofilm batterici. Quando si esegue questa procedura. È importante ricordarsi di prendersi il tempo necessario e di essere il più precisi possibile per ottenere risultati coerenti.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.