Name: Metodo per lisolamento di Francisella tularensis Membrane esterne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-29T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Scopri il metodo per isolare vescicole di membrana esterna da Francisella tularensis mediante lisi osmotica e ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio. Questa tecnica permette di studiare le proteine di membrana e i meccanismi di virulenza batterica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il progetto descritto è stato sostenuto da numeri di Grant P01 AI055637 e U54 AI057156 dal NIAID / NIH. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale dei Programmi RCE Office, NIAID, o NIH.

Giorno 1: F. tularensis piastra inoculazione <ol><li> Piastra colture base congelate di F. tularensis su Mueller-Hinton agar integrato con il 2,5% (vol / vol) donatore nel siero di vitello, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (peso / volume) di glucosio, e 0,025% (peso / volume) pirofosfato di ferro. Crescere F. tularensis a 37 ° C con 5% di CO 2 per circa 24 h. </li></ol> Giorno 2: F. tularensis inoculazione liquido dei media <ol><li> Preparare e autoclave 1 litro di cationi regolato Mueller-Hinton medio (1,23 contenente cloruro di calcio diidrato mM e 1,03 mM cloruro di magnesio esaidrato). Quando sono raffreddati a 37 ° C, media ulteriore supplemento con 0,1% (peso / volume) di glucosio, pirofosfato di ferro 0,025% (peso / volume), e il 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filtro sterilizzare (0,22 μ) di media in due aliquote da 500 ml. </li><li> 12 ml di rimuovere integrato Mueller-Hinton media e il trasferimento in una sterile da 50 ml tubo Falcon. </li><li> Usando una sterile 10 microlitri ansa da inoculo, raschiare un'ansata grande di F. crescita tularensis da piastre di agar (dal giorno 1) e batteri trasferimento in 12 ml di Mueller-Hinton medio (vedi punto 2). Volte la soluzione più pipetta di break-up grumi e preparare omogenea sospensione batterica. Non vortice. </li><li> Utilizzando una pipetta sterile, inoculare ciascuna da 500 ml vaso con 5 ml di sospensione batterica dal punto 3. Grow culture brodo a 37 ° C per 14 a 18 h agitando delicatamente (190-200 giri al minuto su un Brunswick New Innova serie 2300 shaker). </li></ol> 3 ° giorno: Spheroplasting, la lisi osmotica, e la densità centrifugazione gradiente di saccarosio <ol><li> Ottenere F. culture tularensis dal agitazione incubatore e rimuovere una da 1 ml aliquota da ogni 500 ml di cultura per verificare la densità rispettive ottiche. Abbiamo trovato l'estrazione ottimale della membrana e dei risultati quando si usa l'isolamento F. cellule tularensis all'inizio fase logaritmica di crescita, che si correla con un diametro esterno 600 tra 0,2 e 0,4 (~ 10 LUGLIO - 10 AGOSTO UFC / ml). Culture, con un diametro esterno 600 inferiore a 0,2 non produrrà quantità sufficiente di materiali membrana totale per le sfumature saccarosio successive. Al contrario, le culture con un diametro esterno 600 superiore a 0,4 (in via di fase stazionaria) sono stati trovati per produrre misto membrana fusioni. </li><li> Centrifugare culture a 7.500 x g per 30 minuti a 15 ° C per raccogliere le cellule. Si consiglia di centrifugazione di culture in quattro bottiglie da 250 ml centrifuga, perché facilita successiva sospensione a pellet. </li><li> Rimuovere con attenzione il sopranatante media da ogni bottiglia centrifuga e picchiettare le bottiglie in materiale assorbente per eliminare l'eccesso di crescita medio. </li><li> Entro 10 minuti dopo il completamento della centrifugazione, ogni sospensione batterica pellet in 8,75 ml di saccarosio 0,75 M (in 5 mM Tris, pH 7,5). Tutti e quattro i pellet batterico deve essere sospeso e trasferito (35 totale ml di sospensione batterica) ad una sterile pallone da 250 ml (con un piccolo stirbar) entro 10 minuti. </li><li> Mentre dolcemente mescolando la sospensione cellulare su un stirplate, aggiungere lentamente 70 ml (2 volumi) di 10 mm disodico EDTA (in 5 mM Tris, pH 7.8) nel corso di 10 min. Aggiungere la soluzione di EDTA con la punta della pipetta di sotto del livello di sospensione cellulare al fine di evitare elevate concentrazioni locali di EDTA. Il stirbar dovrebbe essere a rotazione ad una velocità sufficiente per mescolare completamente la sospensione cellulare, ma non abbastanza veloce da provocare la formazione di schiuma o bolle. Dopo la soluzione di EDTA è stato aggiunto, incubare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo l'incubazione 30 minuti, aggiungere lentamente 11 ml (° 1 / 10 del volume) di un mg / ml 2 soluzione di lisozima alla concentrazione finale di 200 mg / ml. Continuare a mescolare la sospensione cellulare durante l'aggiunta soluzione di lisozima. Come notato sopra, aggiungere la soluzione di lisozima con la punta della pipetta di sotto del livello del liquido cellulare sospensione per evitare elevate concentrazioni locali di lisozima. Soluzioni madre lisozima (2 mg / ml) possono essere preparati in monouso aliquote e conservati a -20 ° C per 3-4 mesi. Incubare la soluzione così ottenuta per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Durante l'incubazione 30 minuti, preparare un pallone sterile 1L con un piccolo stirbar e 530 ml di temperatura ambiente Cellgro Molecolare Grado dH 2 O (4,5 volumi). </li><li> Osmoticamente lisare la sospensione cellulare (a partire dal punto 6) per diluizione lenta (velocità di flusso di circa 11 ml / min) in 530 ml di dH Molecolare Grado 2 O (dal punto 7) nel corso di 10 a 15 minuti con miscelazione delicata. A causa del volume della soluzione più grandi in questa fase, aumentare la velocità stirbar per garantire la corretta miscelazione. Il stirbar dovrebbe essere a rotazione ad una velocità sufficiente a disperdere completamente la sospensione cellulare, una volta aggiunti ai 2 dH O, ma non abbastanza veloce per portare alla formazione di schiuma o bolle. Aggiungere la sospensione cellulare con la punta della pipetta appoggiato sul fondo del pallone, adiacente al stirbar, per facilitare la diluizione uniforme del cell sospensione. Abbiamo scoperto che da 25 ml pipette funzionano meglio durante questa fase. Monitorare attentamente il processo di diluizione e interrompere il flusso, se necessario, per disperdere gli accumuli locali di cellule, ammassi di cellule, e ciuffi cellulare. Incubare la soluzione così ottenuta per 30 minuti a temperatura ambiente. Si noti che questo passo sembra essere una delle più difficili e critici per il successo globale di questo esperimento. </li><li> Dopo l'incubazione 30 minuti, trasferire 40 ml di soluzione di lisi osmotica in tubi conici da 50 ml e centrifugare a 7500 xg per 30 minuti a 10 ° C per rimuovere le cellule intatte e detriti. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela 27-30 ml di surnatante da ogni tubo conico e surnatanti piscina in un recipiente sterile 1L </li><li> Trasferire 25 ml di surnatante in pool, ciascuna, in 16 tubi ultracentrifuga e centrifugare a 200.000 g (44.400 rpm in F50L-8x39 rotore Fiberlite ultracentrifuga) per 2 ore a 4 ° C. Si noti che ogni rotore contiene 8 tubi, così questo passo richiede due rotori e due ultracentrifughe. In alternativa, la seconda serie di 8 tubi dovrebbero essere tenute a 4 ° C fino centrifugato. </li><li> Entro 10 minuti della fine del percorso ultracentrifuga, preparare modificato risospensione del buffer membrana. Trasferimento 8 ml di tampone membrana sospensione (25% [wt / wt] saccarosio, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) in una provetta sterile e aggiungere 1 compressa di EDTA-free cocktail inibitori della proteasi e 375 U di benzonasi. Mescolare delicatamente la soluzione per sciogliere inibitore della proteasi compressa. </li><li> A seguito di ultracentrifugazione, accuratamente versare off surnatanti, invertire i tubi ultracentrifuga su materiale assorbente e picchiettare tubi per rimuovere il surnatante in eccesso. Segnare la posizione di ciascun pellet membrana con un pennarello per aiutare nella visualizzazione. Risospendere delicatamente otto pellet membrana con 600 microlitri di tampone ogni membrana modificata risospensione. Trasferimento di ogni risospensione membrana per la prossima serie di otto tubi, risospendere delicatamente questi otto pellet, e la piscina resuspensions membrana risultante in un tubo sterile. Le membrane di pellet sono difficili da riportare in sospensione, in modo da continuare a passare la modifica tampone risospensione membrana sopra il pellet fino a quando non si stacca dalla parete del tubo. Spesso è necessario utilizzare la punta micropipetta per raschiare il pellet membrana al largo della parete del tubo e gli aiuti nel processo di risospensione. Quando pipettaggio, evitare la formazione di schiuma o formazione di bolle. Si noti che questo passo sembra essere una delle più difficili e critici per il successo globale di questo esperimento. </li><li> Quando la membrana pellet sono stati risospesi e rimosso da tutti i 16 tubi, lavare ogni quattro tubi con 600 ml di buffer di membrana modificata risospensione. Il lavaggio dovrebbe essere focalizzata intorno alla zona segnata (membrana pellet) di ciascun tubo. Trasferire il lavaggio nel tubo risospensione membrana. Ripetere la fase di lavaggio per i restanti tre serie di quattro tubi. </li><li> Incubare la risospensione membrana con dondolo dolce per 30 minuti a temperatura ambiente per degradare il DNA e l'aiuto nella riduzione del materiale flocculante. </li><li> Rimuovere una piccola aliquota della sospensione membrana ed eseguire la quantificazione di proteine ​​per determinare la resa totale della membrana. Noi di solito preparare non diluito, diluito 1:1 (nel 2,5% SDS), e 1:3 diluito (nel 2,5% SDS) i campioni di membrana, i campioni di calore a 90 ° C per 10 minuti, e utilizzare il BioRad DC Protein Assay per quantificare la membrana risospensione concentrazione proteica. Resa di proteine ​​totali è generalmente compreso tra 1,0 mg / ml e 1,6 mg / ml. L'utilizzo di calore e di SDS sono tenuti a rilasciare OMP dalle membrane estratte in modo che una più accurata quantificazione del valore proteico può essere ottenuto. </li><li> Preparare gradienti di saccarosio lineare stratificazione 1,8 ml ognuna delle soluzioni di saccarosio (peso / peso, preparata in 5 mM EDTA, pH 7,5) in 14 x 95 mm Ultra-Clear tubi ultracentrifuga nel seguente ordine: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Stratificazione di gradienti di saccarosio è più facile da eseguire quando si utilizza una pipetta a bulbo, non un pipettatore automatico. </li><li> Basato sulla quantificazione delle proteine ​​di membrana risospensione (Step 16), strato di 1,5 mg di risospensione membrana in cima ad ogni pendenza. Ogni x 14 95 tubo ultracentrifuga mm ha una capacità massima di 12,5 ml e, visto che 10,8 ml è rappresentata dalle soluzioni di saccarosio a partire dal punto 17, non si deve caricare più di 1,7 ml di risospensione membrana per gradiente. Peso individuale e regolare con cura il peso finale di ogni tubo gradiente di saccarosio (aggiungendo o rimuovendo risospensione membrana) in modo che tutti i tubi pesano uguali (± 0,01 g). </li><li> Trasferimento gradienti di saccarosio in una SW-40Ti rotore oscillante e centrifugare a 256.000 x g (38.000 rpm) per un minimo di 17 ore a 4 ° C. </li></ol> Giorno 4: Raccolta delle frazioni gradiente di saccarosio <ol><li> Dopo 17 h di centrifugazione, fermare la corsa centrifuga, e rimuovere attentamente gradienti di saccarosio dalla SW-40Ti rotore. </li><li> Pulire accuratamente la parte inferiore del tubo gradiente di saccarosio con il 70% di etanolo, la punturafondo della provetta con un ago 21G, e raccogliere frazioni sequenziale 500 microlitri dal gradiente in provette sterili microcentrifuga. Ripetere l'operazione per gradienti successive. Il gradiente dovrebbe essere consentito a gocciolare dal flusso di gravità, in modo da non disturbare il gradiente di saccarosio. Tuttavia, se il gocciolamento cessa dalla parte inferiore del tubo di pendenza, una piccola quantità di pressione può essere applicato alla parte superiore del tubo usando un dito. </li><li> Determinare l'indice di rifrazione di ogni frazione gradiente di saccarosio utilizzando un rifrattometro e correlare l'indice di rifrazione con una densità specifica in g / ml 1. Valutare la localizzazione delle proteine ​​con la preparazione rappresentante frazioni gradiente di saccarosio (incrementi di densità di 0,01, da 1,11 g / ml a 1,26 g / ml) per SDS-PAGE la separazione, il trasferimento di nitrocellulosa, e immunoblotting. </li></ol> Rappresentante Risultati Quando eseguito correttamente, questa procedura comporta la completa separazione di IM e vescicole OM sia da Tipo A (ad esempio SchuS4) e di tipo B (per esempio LVS) ceppi di F. tularensis. Come mostrato in immunoblot rappresentante nella Figura 1, F. OMP tularensis localizzare tra densità di 1,17 e 1,20 g / ml. In confronto, PIM localizzare tra densità di 1,13 e 1,14 g / ml. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Immunoblotting di F. tularensis gradienti di densità di saccarosio. Frazioni sequenziali sono stati raccolti da sfumature e densità (g / ml) sono stati calcolati sulla base degli indici di rifrazione. Le proteine ​​sono state separate mediante SDS-PAGE, trasferite su nitrocellulosa, e immunoblotted per rilevare OMP e frazionamento IMP. mw, prestained standard di peso molecolare con dimensioni (in kDa) ha notato sul lato sinistro di ogni macchia. LVS, lisati di cellule intera F. tularensis LVS. La densità di saccarosio corrispondente frazione del gradiente sono notati sopra le loro rispettive corsie. OMP e PIM, come indicato sul margine sinistro, sono stati rilevati con policlonali, antisieri monospecifici. Risultati simili sono stati ottenuti per F. tularensis SchuS4.

<ol><li>Price, C. A. Centrifugation in density gradients. , Academic Press. 335-335 (1982).</li>
<li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).</li>
<li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+outer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation of outer membranes.</a> Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).</li>
<li>Mizuno, T., Kageyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).</li>
<li>Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Francisella+tularensis+outer+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins.</a> J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).</li>
<li>Huntley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+outer+membrane+proteins+protect+mice+against+pulmonary+challenge+with+virulent+type+A+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis.</a> Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).</li>
<li>Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agglutinins+and+antibodies+to+Francisella+tularensis+outer+membrane+antigens+in+the+early+diagnosis+of+disease+during+an+outbreak+of+tularemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia.</a> J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).</li>
<li>Hubalek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+proteome+database+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Towards proteome database of Francisella tularensis.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).</li>
<li>Pavkova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+tularensis+live+vaccine+strain%3A+proteomic+analysis+of+membrane+proteins+enriched+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction.</a> Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).</li>
<li>Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunospecific+T-lymphocyte+stimulation+by+membrane+proteins+from+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis.</a> J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).</li>
<li>Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T-cell-stimulating+17-kilodalton+protein+of+Francisella+tularensis+LVS+is+a+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein.</a> Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).</li>
<li>Twine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+tularensis+proteome%3A+low+levels+of+ASB-14+facilitate+the+visualization+of+membrane+proteins+in+total+protein+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts.</a> J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo descrive una variazione del spheroplasting, la lisi osmotica, e la densità del gradiente di saccarosio &quot;gold standard&quot; centrifuga per la separazione fisica e l&#39;arricchimento di batteri Gram-negativi OM da altri componenti cellulari 2, 3, 4. Mentre noi precedentemente descritto l&#39;applicazione di questo metodo per isolare OM da entrambi i ceppi di tipo A e tipo B di F. tularensis 5, questa presentazione offre una procedura più dettagliata e ottimizzata per l&#39;isolamento OM. In effetti, questo è un importante passo avanti per identificare potenzialmente superficie esposta e fattori di virulenza presuntiva da questo patogeno mortale. Il significato di questa procedura è stata dimostrata in studi dal nostro laboratorio mostrano che l&#39;immunizzazione di topi con OMP purificata garantita una sostanziale protezione contro la virulenta Tipo A F. tularensis sfida polmonare 6. Come notato sopra, fase di crescita delle cellule batteriche, un attento monitoraggio durante la lisi osmotica e risospensione del pellet delicata membrana sono passaggi critici che sembrano correlare con successo / insuccesso di questa procedura di separazione a membrana. Mentre questo metodo ottimizzato è rigorosa e soggetta a variabilità sperimentale, il conseguente OM sembrano essere di purezza molto maggiore rispetto a quelli ottenuto dall&#39;uso di detergenti, cloruro di litio, sodio o carbonato di 7, 8, 9, 10, 11, 12.

<table><tbody><tr><td>Siero fetale di vitello donatore</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>IsoVitaleX</td><td>BD Biosciences</td><td>211876</td><td></td></tr><tr><td>Cellgro dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O di grado molecolare</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Flacone in policarbonato da 38,5 ml</td><td>FiberLite</td><td>010-0514</td><td></td></tr><tr><td>Rotore per ultracentrifuga F50L-8x39</td><td>FiberLite</td><td>096-087051</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Roche Group</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>Benzonasi</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>Saggio proteico DC</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Provette centrifuga Ultra-Clear da 14x95 mm</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>Rotore a cestelli oscillanti SW-40Ti</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Refrattometro da banco Abbe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-964-10</td><td></td></tr></tbody></table>

metodo per l&#39;isolamento di francisella tularensis membrane esterne

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis è un batterio Gram-negativo coccobacillus intracellulare e l&#39;agente eziologico della tularemia zoonosi. Rispetto ad altri batteri patogeni, la dose infettiva estremamente basso (&lt;10 CFU), malattia a progressione rapida e alta morbilità e mortalità indicano che i ceppi virulenti di Francisella codificano per fattori di virulenza romanzo. Superficie esposta molecole, proteine ​​di membrana e cioè esterna (OMP), hanno dimostrato di promuovere la cellula batterica ospite vincolante, entrata, sopravvivenza intracellulare, la virulenza e l&#39;evasione del sistema immunitario. La rilevanza per lo studio OMP è ulteriormente sottolineata dal fatto che essi possono servire come vaccini protettivi contro una serie di malattie batteriche. Mentre OMP può essere estratto da batteri gram-negativi attraverso le tecniche di estrazione di massa della membrana, tra cui sonicazione di cellule seguita da centrifugazione e / o estrazione detergente, questi preparati sono spesso contaminati da periplasmatico e / o citoplasmatica (interno) della membrana (IM) i contaminanti. Per anni, il &quot;gold standard&quot; metodo per la separazione biochimica e biofisica della gram-negativi IM e membrane esterne (OM) è stato quello di batteri sottoposti a lisi spheroplasting e osmotica, seguita da centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio. Una volta stratificato su un gradiente di saccarosio, OM può essere separata da IMS sulla base delle differenze nella densità di galleggiamento, crede di essere in gran parte basata sulla presenza di lipopolisaccaride (LPS) in OM. Qui, descriviamo un metodo rigoroso e ottimizzato per estrarre, arricchire, e isolare F. tularensis membrane esterne e le loro OMP associati.

Un protocollo per la separazione di membrane interna ed esterna da<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; Da spheroplasting, la lisi osmotica, e la densità ultracentrifugazione gradiente di saccarosio.

Metodo per l&#39;isolamento di Francisella tularensis Membrane esterne

Francisella tularensis è un coccobacillo intracellulare Gram-negativo ed è l'agente eziologico della tularemia, una malattia zoonotica. Rispetto ad altri...

L'isolamento delle vescicole della membrana esterna di Francisella e delle proteine associate alla membrana esterna inizia con la lisi osmotica delle cellule batteriche. I batteri in fase logaritmica vengono trattati in sequenza con soluzioni di saccarosio ipertonico, EDTA e lisozima, prima di essere diluiti lentamente in acqua deionizzata. I lisati batterici ottenuti vengono sottoposti a centrifugazione a bassa velocità, che rimuove i detriti cellulari e le cellule non rotte, seguita da centrifugazione ad alta velocità per ottenere il pellet di vescicole della membrana.Successivamente, le vescicole della membrana totale vengono sovrapposte a gradienti di densità al saccarosio al fine di separare le vescicole della membrana interna (IM) da quelle della membrana esterna (OM). Le vescicole OM possono essere separate dalle vescicole IM in base alle differenze di densità galleggiante, ritenute principalmente dovute alla presenza di lipopolisaccaride (LPS nell'OM). L'immunoblotting di frazioni consecutive provenienti da gradienti di densità al saccarosio mostra una separazione spaziale delle proteine della membrana interna da quelle della membrana esterna. Ciao, sono il dottor Michael Norgaard, e questo è il dottor Jason Huntley del Dipartimento di Microbiologia del Centro Medico UT Southwestern di Dallas.Oggi, il dottor Huntley vi mostrerà un procedimento per estrarre, arricchire e isolare le membrane esterne delle cellule di France cellis e le proteine di membrana associate. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le molecole localizzate nella membrana esterna e potenzialmente esposte sulla superficie di questo patogeno batterico intracellulare. Abbiamo una giornata intensa, quindi cominciamo subito.Per iniziare questa procedura, preparare e coltivare due colture di batteri FCI da 500 millilitri come descritto nel protocollo scritto allegato. Recuperare le colture batteriche dall'incubatore agitato e prelevare un millilitro di Eloqua da ciascuna coltura per la misurazione dell'OD, al fine di ottenere cellule in fase logaritmica iniziale di crescita, corrispondente a un OD 600 compreso tra 0,2 e 0,4. Si ottengono risultati ottimali di estrazione e isolamento delle membrane quando le colture raggiungono l'OD 600 desiderato.Utilizzare quattro provette da centrifuga da 250 millilitri per centrifugare le colture a 7.500 ×g per 30 minuti a 15 °C al fine di raccogliere le cellule. Al termine della centrifugazione, rimuovere con attenzione il sopranatante del mezzo da ciascuna provetta e battere delicatamente le provette su materiale assorbente per eliminare l’eccesso di mezzo di crescita. Entro 10 minuti dal completamento della centrifugazione, sospendere ciascun pellet batterico in 8,75 millilitri di saccarosio 0,75 M in tris 5 mM a pH 7,5.Dopo la sospensione di ogni pellet, trasferire la soluzione in un flacone sterile da 250 millilitri, aggiungendo un piccolo agitatore magnetico. Ripetere per tutti e quattro i pellet batterici, ottenendo una sospensione finale di pellet batterici per un volume totale di 35 millilitri. Mescolare accuratamente la sospensione cellulare su una piastra magnetica, ma non troppo velocemente.Per evitare schiuma o bolle durante il mescolamento lento, aggiungere 70 millilitri di EDTA 10 millimolare alla soluzione nell'arco di 10 minuti. Mantenere la punta della pipetta al di sotto del livello della sospensione cellulare per evitare concentrazioni locali elevate di EDTA. Dopo l'aggiunta dell'EDTA, incubare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente.Quindi, mentre si continua a mescolare lentamente, aggiungere 11 millilitri di una soluzione di lisozima a due milligrammi per millilitro per ottenere una concentrazione finale di 200 microgrammi per millilitro. Continuare a mescolare la sospensione cellulare durante l'aggiunta della soluzione di lisozima. Come in precedenza, mantenere la punta al di sotto del livello della sospensione cellulare.Incubare le cellule con la lisozima per 30 minuti a temperatura ambiente. Durante questa incubazione, preparare un matraccio sterile da un litro con un piccolo agitatore magnetico e 530 millilitri di acqua deionizzata di grado molecolare per colture cellulari a temperatura ambiente.Quando le cellule hanno terminato l'incubazione, lisare osmoticamente la sospensione cellulare utilizzando una pipetta da 25 millilitri, appoggiata sul fondo del flacone adiacente alla barretta magnetica, diluendo lentamente le cellule nell'acqua del flacone da un litro nell'arco di 10-15 minuti con un mescolamento delicato. Questo passaggio è complesso ed essenziale per il successo complessivo dell'esperimento. Il mescolamento deve essere abbastanza rapido da disperdere completamente la sospensione cellulare, ma non troppo veloce da causare schiuma o formazione di bolle, se necessario.Aumentare lentamente la velocità della barretta magnetica per garantire un'adeguata miscelazione. Monitorare attentamente il processo di diluizione e regolare la portata o ruotare il pallone secondo necessità per disperdere accumuli localizzati di cellule, aggregati cellulari e filamenti cellulari. Una volta aggiunte tutte le cellule, incubare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente; al termine dell'incubazione, trasferire aliquote di 40 millilitri della soluzione di lisi osmotica in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare a 7.500 G per 30 minuti a 10 gradi Celsius.Per rimuovere le cellule integre e i detriti dopo la centrifugazione, prelevare con attenzione da ogni provetta conica da 27 a 30 millilitri di sopranatante e raccogliere il sopranatante in un matraccio sterile da un litro. Trasferire 25 millilitri di sopranatante raccolto in ciascuna delle 16 provette per ultracentrifuga e centrifugare a 200.000 G per due ore a quattro gradi Celsius. Dieci minuti prima del completamento della centrifugazione.Preparare il buffer di sospensione della membrana modificato. Combinare otto millilitri di buffer di sospensione della membrana con una compressa di cocktail inibitore delle proteasi privo di EDTA e 375 unità di benzonasi in un tubo sterile e mescolare delicatamente dopo la centrifugazione delle cellule lisate. Procedere al recupero del pellet di membrana.Al termine dell'ultracentrifugazione delle cellule lisate, versare con attenzione il sopranatante, quindi capovolgere i tubi su un materiale assorbente e batterli con decisione. Per rimuovere il sopranatante in eccesso, segnare la posizione di ciascun pellet di membrana con un pennarello per facilitarne la visualizzazione. Ri-sospendere delicatamente otto pellet di membrana con 600 microlitri ciascuno di tampone modificato per la ri-sospensione delle membrane.È difficile risospendere i pellet di membrane. Continuare quindi a passare delicatamente il sospensione Buffer per la risospensione delle membrane modificate sul pellet fino a quando questo si stacca dalle pareti del tubo. Questo è un altro passaggio difficile e fondamentale per il successo complessivo dell'esperimento.Se necessario, utilizzare la punta della micropipetta per staccare il pellet di membrane dalla parete del tubo. Durante la pipettaggio, evitare la formazione di schiuma o bolle, poiché forze di taglio eccessive porterebbero alla formazione di micelle miste, il che esclude la separazione delle membrane. Trasferire ciascuna sospensione di risospensione delle membrane al successivo set di otto tubi.Ri-sospendere delicatamente i pellet rimanenti e raccogliere tutte le sospensioni in un tubo sterile. Dopo aver rimosso i pellet di membrana da tutti e 16 i tubi, lavare ogni gruppo di quattro tubi con 600 microlitri di tampone di sospensione modificato per la ri-sospensione delle membrane. Concentrare il lavaggio sulla zona marcata di ciascun tubo e combinare il lavato con le membrane ri-sospese.Ripetere il lavaggio per le rimanenti provette. Incubare la sospensione della membrana in risospensione con agitazione delicata per 30 minuti a temperatura ambiente per degradare il DNA e favorire la riduzione del materiale flocculente. Successivamente, prelevare un piccolo campione della sospensione della membrana ed eseguire la quantificazione delle proteine.Per determinare il rendimento totale della membrana, preparare una diluizione da uno a uno e da uno a tre della sospensione della membrana in SDS al 2,5%, riscaldando le sospensioni non diluite da uno a uno e da uno a tre a 90 gradi Celsius per 10 minuti. L'SDS e il calore sono necessari per rilasciare l'O MPS dalle membrane estratte. Utilizzare il saggio proteico BioRad DC per quantificare la concentrazione proteica della risospensione della membrana.Il rendimento totale di proteine è generalmente compreso tra uno e 1,6 milligrammi per millilitro. Una volta determinata la concentrazione di proteine nella preparazione delle membrane, i campioni possono essere separati su un gradiente di saccarosio. Iniziare preparando una serie di soluzioni di saccarosio in EDTA.Per preparare i gradienti lineari di saccarosio, utilizzare una pipetta a bolla per stratificare 1,8 millilitri di ogni soluzione di saccarosio in provette ultracentrifughe UltraClear da 14 per 95 millimetri, nell'ordine seguente: 55%, 50%, 45%, 40%, 35% e 30%. Successivamente, stratificare 1,5 milligrammi di sospensione di membrane resus sulla cima di ogni gradiente. Non caricare più di 1,7 millilitri di sospensione di membrane resus per gradiente; pesare singolarmente ogni provetta e regolare attentamente il peso finale aggiungendo o rimuovendo sospensione di membrane resus in modo che tutte le provette abbiano lo stesso peso. Trasferire i gradienti di saccarosio in un rotore a cestelli oscillanti SW 40 TI e centrifugare a 256.000 ×g per un minimo di 17 ore a quattro gradi Celsius.Dopo 17 ore di centrifugazione, arrestare la corsa della centrifuga e rimuovere con attenzione i gradienti di saccarosio dal rotore. Successivamente, raccogliere le frazioni. Pulire accuratamente il fondo del tubo del gradiente di saccarosio con etanolo al 70%.Quindi perforare la parte inferiore del tubo con l'ago da 21 gauge e raccogliere frazioni sequenziali da 500 microlitri dal gradiente in tubi microcentrifuga sterili. Il gradiente dovrebbe scorrere per gravità, in modo da non disturbare il gradiente di saccarosio. Tuttavia, se il gocciolamento cessa dalla parte inferiore del tubo del gradiente, si può applicare una piccola pressione sulla sommità del tubo utilizzando un dito.Infine, determinare l'indice di rifrazione di ciascuna frazione del gradiente di saccarosio utilizzando un rifrattometro, correlando l'indice di rifrazione a una densità specifica espressa in grammi per millilitro. Valutare la localizzazione proteica di frazioni rappresentative del gradiente di saccarosio mediante separazione tramite elettroforesi SDS-PAGE e immunoblotting. Di seguito è riportato un immunoblot delle frazioni del gradiente di saccarosio utilizzato per separare le membrane estratte dal ceppo vaccinale vivo Freis, in cui le proteine della membrana esterna (Omps) si localizzano tra densità di 1,17 e 1,2 grammi per millilitro.In confronto, le proteine della membrana interna o ips localizzate tra densità di 1,13 e 1,14 grammi per millilitro. Risultati simili sono stati ottenuti per il ceppo FHU quattro. Ho appena dimostrato come estrarre e isolare le vescicole della membrana esterna di Francisella mediante lisi osmotica e ultracentrifugazione su gradiente di densità di saccarosio.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare cellule batteriche nelle fasi iniziali della crescita logaritmica, diluendo lentamente ma costantemente tali cellule batteriche in acqua deionizzata durante il passaggio glicolitico osmotico e di prestare attenzione durante la risospensione dei pellet della membrana ottenuti mediante ultracentrifugazione. Questo conclude la nostra procedura di separazione delle membrane. Grazie per aver guardato e buona fortuna nei vostri futuri esperimenti.

method-for-the-isolation-of-francisella-tularensis-outer-membranes

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Cian, M. B. et. al., Separazione dell'involucro cellulare per batteri Gram-negativi in frazioni di membrana interna ed esterna con aggiustamenti tecnici per Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)Questo video mostra la separazione delle frazioni di membrana interna ed esterna dei batteri Gram-negativi utilizzando l'ultracentrifugazione a gradiente di saccarosio. Le frazioni di membrana vengono purificate e conservate a basse temperature per un'analisi mirata dei componenti specifici...

Separazione delle frazioni di membrana interna ed esterna di batteri Gram-negativi

Fonte: Watson, DC, et.al. Isolamento e purificazione scalabili di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra l'isolamento e la concentrazione di vescicole extracellulari (EV) derivate dalla membrana esterna di batteri geneticamente modificati. Il processo prevede la coltura dei batteri per rilasciare le vescicole extracellulari, seguita da fasi sequenziali di centrifugazione e filtrazione per rimuovere cellule e detriti. Infine,...

Isolamento e arricchimento di vescicole extracellulari derivate dalla membrana esterna da batteri

Fonte: Jung, A. L., et al. Vescicole della membrana esterna di Legionella pneumophila: isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatorio sui macrofagi. J. Vis. Esp. (2017)Questo video dimostra l'isolamento delle vescicole della membrana esterna (OMV) da Legionella pneumophila tramite centrifugazione sequenziale, filtrazione sterile e ultracentrifugazione. Gli OMV purificati, arricchiti con proteine di membrana e lipopolisaccaridi, sono adatti per studi di interazione ospite-patogeno.

Isolamento basato su ultracentrifugazione delle vescicole della membrana esterna di Legionella pneumophila

Questo protocollo descrive intratracheale inoculazioni di Fischer 344 ratti con Francisella tularensis. Questa procedura imita polmonare dell'esposizione degli esseri umani a questo potenziale agente di biothreat e può essere utilizzato per testare il vaccino ed efficacia terapeutica contro tularemia polmonare.

Intratracheale inoculazione di Fischer 344 ratti con Francisella tularensis

Questo metodo fornisce un quadro per studiare l'incorporazione di acidi grassi esogeni da sorgenti ospiti complesse in membrane batteriche, in particolare Staphylococcus aureus. Per raggiungere questo obiettivo, vengono descritti i protocolli per l'arricchimento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uova di gallina e la successiva profilazione dell'acido grasso di fosfatidi batterici che utilizzano la spettrometria di massa.

Isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dell'incorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana

Mycobacterium tuberculosis mostra un aumento della produzione e del rilascio di vescibole extracellulari in risposta a basse condizioni di ferro. Questo lavoro descrive in dettaglio un protocollo per la generazione di basse condizioni e metodi di ferro per la purificazione e la caratterizzazione delle vesciche extracellulari micobatteriche rilasciate in risposta alla carenza di ferro.

Isolamento e caratterizzazione delle vescicoli extracellulari prodotti da micobatteri a limite di ferro

I batteri Gram-negativi producono due membrane selvadenti spazialmente. La membrana esterna è partizionata dalla membrana interna da un periplasma e da uno strato peptidoglycan. La capacità di isolare i doppi bistrati di questi microbi è stata fondamentale per comprendere la loro fisiologia e patogenesi.

Separazione dell'involucro cellulare per i batteri Gram-negativi in frazioni di membrana interne ed esterne con regolazioni tecniche per Acinetobacter baumannii

Le vescicole batteriche svolgono un ruolo importante nella patogenesi e hanno promettenti applicazioni biotecnologiche. L'eterogeneità delle vescicole complica l'analisi e l'uso; pertanto, è necessario un metodo semplice e riproducibile per separare le varie dimensioni delle vescicole. Qui, dimostriamo l'uso della cromatografia di esclusione dimensionale per separare vescicole eterogenee prodotte da Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Cromatografia di esclusione dimensionale per analizzare l'eterogeneità delle vescicole della membrana esterna batterica

I batteri secernono vescicole extracellulari (EV) di dimensioni nanometriche che trasportano molecole biologiche bioattive. La ricerca EV si concentra sulla comprensione della loro biogenesi, del ruolo nelle interazioni e malattie microbo-microbo e ospite-microbo, nonché sulle loro potenziali applicazioni terapeutiche. Viene presentato un flusso di lavoro per l'isolamento scalabile dei veicoli elettrici da vari batteri per facilitare la standardizzazione della ricerca sui veicoli elettrici.

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia TIRF per tracciare i singoli canali ionici e determinare la loro attività nelle membrane lipidiche supportate, definendo così l'interazione tra il movimento laterale della membrana e la funzione del canale. Descrive come preparare le membrane, registrare i dati e analizzare i risultati.

Imaging a singola molecola della mobilità laterale e dell'attività dei canali ionici in doppi strati lipidici mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Sebbene i procarioti manchino di un sistema organellare, ci sono regioni subcellulari con proteine localizzate. L'analisi quantitativa e qualitativa degli enzimi e delle proteine nelle regioni subcellulari è importante per lo sviluppo di bersagli di farmaci e vaccini. Qui, illustriamo il frazionamento subcellulare delle proteine Leptospiral utilizzando Triton X-114 e la sua analisi.

Arricchimento di proteine subcellulari in Leptospira utilizzando un approccio di frazionamento basato su Triton X-114

Scopri il metodo per isolare vescicole di membrana esterna da Francisella tularensis mediante lisi osmotica e ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio. Questa tecnica permette di studiare le proteine di membrana e i meccanismi di virulenza batterica.

Metodo per l'isolamento di Francisella tularensis Membrane esterne

Esplora altri video