Name: Ultrasound-Guided Microiniezione nel proencefalo mouse In Utero A E9.5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Impara la microiniezione guidata da ultrasuoni nel proencefalo di embrioni di topo in utero a E9.5. Questa tecnica consente la manipolazione dell'espressione genica nelle cellule della zona germinale prima della neurogenesi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Parte 1. Preparare l'area chirurgica <ol><li> Se si lavora con reagenti rischio biologico (ad esempio vettori retrovirali), l'intervento deve essere eseguito all'interno di un armadio II Biosicurezza (BSC). Il microscopio backscatter ultrasuoni (UBM) dovrebbe sedersi accanto al BSC, con il trasduttore all'interno della BSC, e tenuto in posizione da un supporto motore controllato su un palco appositamente progettato chirurgica. I componenti necessari per costruire lo stadio mostrato nel video sono elencati in linea. Questo elenco, insieme ad immagini della scena da diverse angolazioni (disponibile a richiesta), dovrebbe consentire la costruzione. </li><li> L'apertura e chiusura della laparotomia (procedura chirurgica in cui viene tagliata la cavità addominale aperta per consentire l'accesso agli organi interni) è di solito eseguita su un tampone assorbente con supporto di plastica. Prima dell'intervento tutti gli strumenti necessari (es. rasoio, forbici chirurgiche, pinze, caricato autoclip applicatore, ecc) e materiali (ad esempio PBS, suture, anestetico, il supporto per mouse e la piastra sovrastante, ecc) devono essere sterilizzati e collocato nel Area chirurgica. Limitando la quantità di tempo l'incisione è aperto è importante per ottimizzare le possibilità di successo con la chirurgia. Tutti trattamento degli animali deve essere effettuata con guanti che sono stati disinfettati con MB-10 soluzione, o equivalente. Disinfezione ripetuta deve essere eseguita secondo necessità per assicurare che i guanti sono sterili. </li></ol> Parte 2. Anestesia del mouse <ol><li> Riempire una siringa da 1 cc, con la soluzione anestetica contenente 1 parte di Nembutal (50 mg / ml pentobarbital) a 4 parti filtrata sterile 25 mg / ml di solfato di magnesio in PBS. Questo si tradurrà in una soluzione che è di 10 mg / ml pentobarbital e 20 mg / ml di solfato di magnesio. Ogni mouse dovrebbe essere ponderata individualmente, e iniettati con 90 mg di pentobarbital per kg di peso corporeo (per esempio, di 28 topo gm sarebbe iniettato con 250 mL). </li><li> Iniettare nell'addome (intraperitoneale, IP) di un topo in stato di gravidanza al giorno embrionale (E) 9.5 (possono usare altre età, se necessario) penetrante sia la pelle ei muscoli addominali. Lasciare 8-12 minuti per il mouse per non rispondere. Anestesia adeguata dovrebbe essere confermato dalla postura rilassata dell'animale, e la mancanza di movimento in risposta a coda e pizzichi piedi. Pizzicando delicatamente tra le unghie è molto sensibile, e la mancanza di qualsiasi risposta a pizzicare tale indica che l'animale sia sufficientemente anestetizzati. Si noti anche gli animali che sono completamente insensibili a pizzichi coda e punta può alcune volte contrazione leggermente in risposta alla prima incisione chirurgica. Tuttavia, questa è una risposta riflessiva e non indica l'anestesia inadeguata. A base di petrolio balsamo oftalmico deve essere applicato agli occhi del mouse per evitare l'essiccamento durante l'intervento. </li><li> Set-up l'area chirurgica e la macchina ad ultrasuoni in attesa del mouse per diventare anestetizzati. Poiché l'uso di retrovirus e lentivirus richiede BSL2 di contenimento, come detto in precedenza le iniezioni virale deve essere eseguita in un gabinetto biosicurezza II. Inoltre, tutte le soluzioni e materiali usa e getta che viene a contatto con il virus dovrebbe essere decontaminate con una soluzione di candeggina al 10%. Gli strumenti chirurgici e apparecchiature ad ultrasuoni devono essere trattati con una soluzione sterilizzante come MB-10 ( <a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a> ) o un equivalente utilizzato dalla struttura in questione. </li></ol> Parte 3. Esposizione della embrioni <ol><li> Se possibile (a seconda dei vincoli della struttura determinato animale e lo spazio disponibile), si preferisce avere l'area chirurgica preparazione in un luogo separato dalla zona chirurgica. Questo ridurrà al minimo le possibilità di contaminazione incrociata tra gli animali. Per avviare l'intervento, posto l'animale sul dorso su una superficie sterile assorbente e lavare la zona addominale accuratamente con etanolo al 70%. Trattamenti prechirurgica più ampia può essere impiegata (ad esempio, turni successivi di Betadine e lavaggi etanolo al 70%), ma nella nostra esperienza questo non è necessario per questo tipo di chirurgia roditori sopravvivenza. Utilizzando un rasoio a doppio taglio, radere i capelli con l'addome in una zona di circa 1 cm di larghezza e 1,5 centimetri di lunghezza. Utilizzare brevi movimenti rapidi con il rasoio a circa un angolo di 45 °. E 'importante che l'area chirurgica essere opportunamente trattata, ma non sottoposto a bagnatura eccessiva, in quanto ciò può causare agghiacciante inutile degli animali, e forse anche l'ipotermia. </li><li> Utilizzando bene forbici chirurgiche fare un 1 "incisione longitudinale attraverso la pelle, e poi attraverso il muscolo addominale dell'animale (taglio attraverso il tessuto connettivo tenendo la pelle al muscolo aiuterà con la seconda incisione). Noti che per tutta la cura procedura dovrebbe da adottare per assicurare che gli strumenti chirurgici rimangono sterili, e il trattamento con disinfettante deve essere eseguito secondo le necessità (cioè se le punte di entrare in contatto con i non-sterile materiale). </li><li> Forcipe utilizzando attentamente tirare fuori le corna uterine, e registrare il numero di embrioni da ogni lato. Pur lasciando due embrioni adiacenti esposti (selezione di cui due dipenderà dalla configurazione su ogni lato), posto la maggior parte delle corna uterine nuovamente dentro l'animale. In questo contesto, due embrioni saranno esposti in un dato momento e bagnato in PBS, mentre la madre rimane sulla schiena. </li><li> Posto l'animale sul dorso nel supporto in plexiglass dove sarà durante l'intervento chirurgico (Figure1A) *. Successivamente, abbassare il tessuto piatto 10 centimetri cultura ** (che dovrebbe essere disinfettato con MB-10 prima dell'uso) giù sopra la madre, con un paio di pinze posizionati leggermente attraverso la membrana verde silastic (realizzati con L silicone RTV base in gomma, e catalizzatore;-Dow Corning numeri di prodotto 3142761 e 2156946, rispettivamente). Mentre si abbassa il piatto sopra l'animale, utilizzare la pinza per afferrare il tessuto uterino tra i due embrioni da iniettare, e delicatamente tirare attraverso la membrana. Allo stesso tempo, la lastra si abbassa completamente verso il basso sul supporto, e le puntine da disegno sono spinti per tenerlo in posizione. Pre-riscaldato (a 37 ° C) PBS viene quindi aggiunto il piatto per coprire completamente gli embrioni. </li><li> Posizionare la fase di iniezione contenente l'animale e gli embrioni esposti sotto la sonda ecografica (Figure1A) per creare in tempo reale immagini degli embrioni esposti attraverso la parete uterina (Figure1B). La sonda viene quindi abbassato (utilizzando i comandi motorizzati) nel bagno di PBS direttamente sopra gli embrioni da acquisire. Le immagini possono essere ottenuti quando la sonda è di circa 2-3 mm di distanza dalla embrioni. E 'molto importante fare in modo che la sonda non colpisce gli embrioni in quanto oscilla avanti e indietro per raccogliere le immagini. </li></ol> * Il titolare della madre riposa in durante l'intervento chirurgico può essere facilmente effettuata da un officina meccanica. Esso dovrebbe includere una larga base in plexiglass, con due lati plexiglass incollato sulla parte superiore, e uno spazio tra di loro (abbastanza largo per il mouse per adattarsi mentre giaceva sul dorso). Le parti dovrebbero avere un terreno valle fuori di essi, che viene poi riempito con cera nera (per esempio da un vassoio dissezione). Cera che serve come il materiale in cui puntine da disegno sarà premuto per tenere premuto il piatto di PBS che gli embrioni sono immersi in durante l'iniezione. ** Piatti 10 centimetri batterica dovrebbe avere un foro (circa 2 centimetri di diametro) perforato dal centro del fondo (questo può essere fatto con un Heavy Duty portatile Punch e un 13/16 ° morire pollici circolare: <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm</a> ). Inoltre, due piccoli fori su entrambi i lati del foro centrale (circa 1,5 centimetri di distanza) deve essere bruciato con una fiamma riscaldato ago (o potrebbero essere effettuato con un trapano, naturalmente). Questi fori vengono poi coperti di grasso per vuoto e sarà dove il puntine che tengono la piastra sul supporto nel far passare la cera nera. Il grasso è vuoto per evitare la fuoriuscita dalla PBS. Parte 4. Caricamento Virus in un ago Microiniezione <ol><li> Moda microiniezione di un ago smusso appena 1 mm (diametro interno) tirato capillare di vetro. La nitidezza dell'ago è critica, e lavorando con un ago sufficientemente forte può seriamente compromettere la penetrazione della parete uterina e il sacco amniotico, e può portare al fallimento sperimentale. L'ago affilato è poi inserito nel supporto pipetta, che è collegato tramite tubo a una microsiringa 25 microlitri montato in un manuale di infusione / ritiro della pompa (altri dispositivi possono essere usati per regolare il carico e lo scarico dell'ago, ma questo è ciò che è mostrato nel video). Per la risposta ottimale (per evitare l'espansione e la compressione associata ad un sistema ad aria piena), la microsiringa, tubi, e l'ago dovrebbe essere riempita con olio minerale. </li><li> Prima di caricare l'ago assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nel sistema dalla siringa fino alla punta dell'ago. Poi ritiratevi una piccola bolla d'aria (1-2 mm di lunghezza) nel l'ago prima di iniziare a caricare virus. Questa sacca d'aria aiuta a mantenere la separazione tra il virus e l'olio minerale. Lo stock virale da iniettare deve contenere polibrene ad una concentrazione finale di 0,08 mg / ml (per ulteriori informazioni sulla produzione di virus si rimanda a riferimenti 1, 2). Si noti che concentra le scorte retrovirali generalmente contengono una significativa quantità di particolato, che contiene la maggior parte del materiale infetto, e quindi non possono essere filtrati senza un 5 - a goccia di 10 volte del titolo. Inoltre, a seconda della preparazione, lo stock virale può essere viscoso dal DNA genomico di cellule lisate imballaggio (particolarmente vero se si usa 293 cellule per generare MLV / VSV virus pseudotyped). Se l'aliquota del virus è viscoso, una piccola quantità di DNasi I può e deve essere aggiunto per allentare lo stock, o caricando l'ago sarà estremamente difficile. A goccia del titolo virale (8-10 mL) deve essere collocato su un pezzo di parafilm sterile in preparazione per il carico ago. Quindi, utilizzando la pompa di recesso, accuratamente caricare l'attenzione ago pagare per evitare intasamenti. Posizionare l'ago caricato nella posizione micromanipolatore nella zona di iniezione, facendo attenzione a non rompere l'ago sulla embrioni, o la sonda ecografica. Si noti che se per qualche motivo l'ago viene caricato in maniera significativa prima che l'iniezione è che si verifichi può essere utile per disegnare una piccola quantità di aria nella punta, che può essere scaricato prima di iniziare le iniezioni. Questa sacca d'aria in grado di proteggere contro il calcio virale essiccazione sulla punta dell'ago (un evento che sarà quasi sempre di rendering che l'ago caricato inutile). </li></ol> Parte 5. Ecografia iniezione guidate Viral <ol><li> L'immagine in tempo reale creato dalla sonda ecografica viene visualizzata sul monitor video, e può essere utilizzato per guidare l'ago microiniezione in embrione. Utilizzando questo virus sistema può essere iniettato nel sacco amniotico a E8.5 o sia il sacco amniotico o il sistema ventricolare da E9.5-E11.5 (Figure1B). Questa è la parte più difficile della procedura e richiede una notevole quantità di mani su esperienza di padroneggiare (dell'ordine di 5-20 ore a seconda del ricercatore). La punta dell'ago è evidente nell'immagine ultrasuoni come il punto più chiaro sullo schermo, e dovrebbe essere visto in movimento in conformità con le regolazioni della posizione della sonda (utilizzando i controlli motorizzati nelle y z e aerei, e il controllo manuale della x piano). E 'estremamente importante che la direzione di oscillazione della sonda essere parallela alla lunghezza dell'ago. Ciò assicurerà che la punta dell'ago rimane nel piano dell'immagine durante i movimenti di posizione che per l'iniezione in embrione. </li><li> L'embrione deve essere posizionato in modo tale che la regione di destinazione (in questo caso il ventricolo proencefalo) è facilmente visibile e accessibile a l'ago con la minor quantità di materiale uterina nel percorso di iniezione. Inoltre, è fondamentale non iniettare attraverso la placenta. Una volta che la regione del cervello target è allineato con la direzione di avanzamento ago (con la manopola sul micromanipolatore), l'ago deve essere sfiora la parete uterina, e poi un colpo corto veloce in avanti dovrebbe penetrare il tessuto. Un approccio simile è utilizzato per penetrare il sacco amniotico e poi il cervello. In alcuni casi, ricercatore ed esperto in grado di colpire il ventricolo in un unico movimento, soprattutto se l'ago è molto forte. La meccanica del movimento della sonda, l'ago, e gli embrioni (spostando la madre sul palco), richiedono hands-on di pratica per padroneggiare. </li><li> Una volta che il numero desiderato di embrioni è stato iniettato, in prossimità della parete addominale con 5,0 punti di sutura di seta. La meccanica di sutura non sono specifici per questo tipo di chirurgia. Infine, l'uso autoclips veterinaria di base della pelle assieme sui punti nei muscoli addominali. Sutura la pelle non è raccomandato perché il mouse masticare fuori i punti. Analgesia deve essere applicato alla zona di incisione per ridurre la quantità di dolore provato con il mouse come lo risveglia. Si consiglia una soluzione bupivacaina 0,25% da iniettare (0,8 ml / kg, o 2 mg / kg) per via sottocutanea ogni pochi millimetri lungo il sito di incisione. </li><li> Mentre il mouse recupera appoggiare delicatamente l'animale su carta assorbente in una gabbia pulita contenente una confezione di gel (per facilitare l'alimentazione e idratazione). Posizionare la gabbia su un set di diapositive più calda a 37 ° C per mantenere la temperatura corporea. Quando si risveglia, posizionare il mouse e la confezione di gel in una gabbia pulita e tornare al rack animale. </li><li> Il giorno successivo controllare il mouse di qualsiasi sanguinamento vaginale, contrazioni addominali, e / o uno sguardo d'insieme in difficoltà, che indicano l'aborto. Se questo è il caso, l'eutanasia il mouse immediatamente. Capelli ben curati e un aspetto sano generale indicano recupero di successo da un intervento chirurgico. Gli embrioni iniettato può essere sacrificato embrionalmente o dopo la nascita per ulteriori analisi. Se il virus esprime un gene reporter, come la fosfatasi alcalina umana (PLAP) o GFP, una colorazione rivelerà zone di positivo infezione virale (Figure1C). </li></ol> Rappresentante Risultati Embrioni iniettato può essere sacrificato 1-2 giorni dopo l'iniezione fino in fondo fino all'età adulta. Se il virus esprime un gene reporter, come PLAP o GFP, allora espressione giornalista serve per identificare le cellule infettate virale e cloni di quelle cellule. Per esempio, mostrato nella Figura 1C è una sezione di tessuto di un cervello post-natale che è stato infettato in utero a E9.5 con un vettore retrovirale PLAP esprimere. Cellule infette vengono visualizzati come grappoli viola dopo la colorazione istochimica. Oltre a identificare le cellule infettate virale, espressione giornalista permette di esaminare la morfologia cellulare e la posizione, così come lo stato di espressione genica. nt "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Iniezione virale nel topo E9.5 ventricoli proencefalo. A. L'animale anestetizzato è posta sulla fase di iniezione. Due embrioni sarebbe esposto e posizionato sotto la sonda ecografica dove indicato (freccia). L'ago microiniezione pieno di virus si trova vicino al embrioni e allineati con la sonda ad ultrasuoni. Schermo B. cattura di un immagine in tempo reale ad ultrasuoni da un embrione di topo E9.5. V, ventricolo, AS, sacco amniotico; UW, parete uterina. Embrioni C. è stato iniettato un virus PLAP che esprimono a 10,5. Colorazione istochimica per PLAP rivela la posizione degli eventi infezione virale.

<ol><li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li>
<li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Iniezioni virale con guida ecografica può essere condotta da E8.5-E11.5, dove solo il sacco amniotico può essere iniettato a E8.5, mentre sia il sacco amniotico e il sistema ventricolare può essere iniettato da E9.5-E11.5. Quando eseguito correttamente, particelle virali iniettato nel sistema ventricolare sotto controllo ecografico ha accesso alle cellule che rivestono il sistema ventricolare e, quindi, può infettare le varie strutture della (neocorteccia, gangli basali, diencefalo, occhio, ecc) proencefalo, mesencefalo , e romboencefalo (Figure1C). Virus iniettato nel sacco amniotico ha accesso alle celle sulla parte esterna dell&#39;embrione. Oltre a virus, guida ecografica può essere utilizzato anche per iniettare le cellule in un embrione di sviluppo. Pertanto, questa tecnica offre molteplici opzioni tra cui scegliere (periodo di sviluppo, la struttura, virus / cellule) durante la progettazione di un esperimento. E &#39;fondamentale che il virus iniettato o cellule esprimono un reporter per una facile identificazione delle cellule infette / iniettato. Storicamente, umano fosfatasi alcalina placentare (PLAP) o GFP sono stati utilizzati. Per esperienza, abbiamo trovato PLAP può essere un gene reporter molto utile perché sia ​​PLAP istochimica e immunoistochimica produce una cellula netta e distinta singola macchia che permette di analizzare la morfologia delle cellule e la posizione, e per realizzare una analisi clonale. Dal momento che l&#39;espressione GFP virale può essere debole, un reporter GFP può non essere ideale per la colorazione dei tessuti, ma è utile se si vuole ottenere singole cellule ordinando fluorescenza delle cellule attivate (FACS).

&quot;Uno dei microscopi seguenti backscatter ultrasuoni possono essere usati per questa procedura. Anche se nel video del P40 da Paradigm-medica è utilizzato, il P40 non è più disponibile in commercio, ed è stato sostituito dal P60, che è allo stesso prezzo e può essere utilizzato per la stessa applicazione. I materiali aggiuntivi descritti per la costruzione fase sono per l&#39;uso con Paradigma-Medical device (s). Vevo Il 2100 è dotato di attrezzature per l&#39;imaging di piccoli animali. <ol><li> P60 biomicroscopio ultrasuoni (UBM) da Paradigma-Medical ( <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ). </li><li> Vevo 2100 da VisualSonics ( <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ) </li></ol> Anestetici e analgesici La soluzione Nembutal (50 mg / mL di sodio pentobarbital iniettabili; prodotto da Abbott Laboratories) può essere ottenuto da Bulter Salute Animale Schein. Si noti che questa è una sostanza elenco II controllato e richiede un Drug Enforcement Agency (DEA) che autorizza ad ottenere. La soluzione di bupivacaina (0,25%, prodotta da Hospira, Inc., tra gli altri) può essere ottenuto da una serie di distributori, tra cui Moore Medical.

ultrasound-guided microiniezione nel proencefalo mouse in utero a e9.5

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Nella chirurgia in utero sopravvivenza in topi permette la manipolazione molecolare dell&#39;espressione genica durante lo sviluppo. Tuttavia, poiché la parete uterina è opaco durante l&#39;embriogenesi precoce, la possibilità di individuare specifiche parti dell&#39;embrione per microiniezione è molto limitata. Fortunatamente, ad alta frequenza ecografia permette la generazione di immagini che possono essere utilizzati in tempo reale per guidare un ago microiniezione nella regione embrionale di interesse. Qui si descrive l&#39;uso di imaging, per guidare l&#39;iniezione di vettori retrovirali nel sistema ventricolare del prosencefalo topo al giorno embrionale (E) 9.5. Questo metodo utilizza una laparotomia per consentire l&#39;accesso ai corni uterini, e un piatto appositamente progettato che permette di ospitare gli embrioni di essere immerso in soluzione salina mentre sono ripreso e iniettata. Interventi chirurgici di successo spesso sfociano in tutti o quasi tutti gli embrioni iniettati sopravvivere a qualsiasi momento successivo punto di interesse (embrionalmente o dopo la nascita). I principi qui descritto può essere usato con lievi modifiche per eseguire le iniezioni nel liquido amniotico di E8.5 embrioni (permettendo così l&#39;estensione dell&#39;infezione lungo anteriore posteriore del tubo neurale, che non è ancora chiuso), o nel sistema ventricolare del cervello E10.5/11.5. Inoltre, a metà neurogeno età (~ E13.5), ecografia può essere usata l&#39;iniezione diretta in regioni specifiche del cervello per infezione virale o trapianto di cellule. L&#39;uso di ecografia per guidare in utero iniezioni nei topi è una tecnica molto potente che permette la manipolazione molecolare e cellulare di embrioni di topo in un modo che sarebbe altrimenti estremamente difficile se non impossibile.

Nella chirurgia in utero sopravvivenza in topi permette la manipolazione molecolare dell&#39;espressione genica durante lo sviluppo. Qui si descrive l&#39;utilizzo di alta frequenza ecografia per guidare l&#39;iniezione di vettori retrovirali nel cervello di topo al giorno embrionale (E) 9.5.

Ultrasound-Guided Microiniezione nel proencefalo mouse In Utero A E9.5

La chirurgia di sopravvivenza in utero nei topi consente la manipolazione molecolare dell'espressione genica durante lo sviluppo. Tuttavia, poiché la parete uterina è opaca...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di somministrare vettori retrovirali nella parte anteriore del cervello del topo prima dell'inizio della neurogenesi in quella regione. Questo metodo permetterà la trasduzione delle cellule della zona germinale con geni di interesse. Altri vettori virali o cellule potrebbero essere iniettati anche utilizzando questo metodo.Questo viene effettuato eseguendo innanzitutto una laparotomia su un topo gravido anestetizzato, che consente l'accesso agli embrioni. Il secondo passaggio della procedura consiste nel posizionare il topo gravido sul supporto per l'iniezione al di sotto del trasduttore ecografico. Successivamente, posizionare gli embrioni sulla piastra per l'iniezione.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'utilizzare l'immagine ecografica in tempo reale per guidare l'ago di microiniezione verso il sito bersaglio dell'iniezione. Gli embrioni vengono iniettati in serie fino al completamento del numero desiderato. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel rimuovere il topo dall'apparato di iniezione e richiudere le incisioni nella parete corporea, nel muscolo e nella pelle.All'animale viene quindi permesso di riprendersi. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la localizzazione e le caratteristiche fenotipiche delle cellule infette mediante il rilevamento di un determinato gene reporter in sezioni di tessuto e la marcatura con marcatori specifici per tipo cellulare. Ciao, sono Taryn Pier Fois del laboratorio di Nick Guyano nel programma di Neurogenerazione presso la Johns Hopkins University School of Medicine.Oggi vi mostreremo un procedimento che utilizza l'immagine ecografica per guidare la microiniezione di vettori retrovirali nel cervello del topo in utero al giorno embrionale 9,5. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare l'effetto della manipolazione dell'espressione genica durante lo sviluppo del cervello su comportamento delle cellule staminali neurali e progenitrici e specificazione dei solfati. Cominciamo dunque.Se le iniezioni devono contenere vettori virali ingegnerizzati, la procedura deve essere eseguita all'interno di una cappa di sicurezza biologica di livello due. Posizionare un topo gravido anestetizzato in posizione supina. Utilizzare forbici chirurgiche fini per praticare un'incisione longitudinale di un pollice attraverso la cute lungo la linea mediana.Rimuovere il tessuto connettivo situato tra la pelle e il muscolo che circonda l'incisione. Successivamente, praticare un'incisione leggermente più corta attraverso il muscolo addominale utilizzando pinze. Estrarre delicatamente le corna uterine.Registrare il numero di embrioni su ciascun lato. Trasferire l'animale sul supporto per iniezioni in plexiglass. Per proteggere gli embrioni.Rimettere nella cavità animale la maggior parte dei corni uterini, lasciando esposti solo due embrioni adiacenti. Utilizzare una piastra di Petri da 10 centimetri con due piccoli fori per puntine da disegno e un foro centrale da due centimetri sigillato con un pezzo di membrana scolastica per mantenere gli embrioni umidi. Con un paio di pinzette inserite leggermente attraverso la membrana scolastica.Abbassi la piastra sulla madre. Mentre la piastra viene abbassata, afferrare il tessuto uterino tra i due embrioni selezionati e tirarli delicatamente attraverso la membrana quando la piastra viene seminata.Fissatelo con due puntine da disegno attraverso i fori più piccoli e nella cera. Riempite la piastra con PBS 1X a 37 gradi Celsius per mantenere gli embrioni umidi. Orientate gli embrioni parallelamente alla lunghezza della madre.Posizionare la fase di iniezione sotto la sonda ecografica. Abbassare la sonda a circa due-tre millimetri sopra gli embrioni. Per ottenere immagini ecografiche nitide, è fondamentale che la testa della sonda non urti gli embrioni mentre oscilla avanti e indietro.Per raccogliere le immagini, collegare l'ago a una microssiringa da 25 microlitri montata su una pompa manuale per infusione e prelievo. Inserire un ago per microiniezione smussato e affilato in un portapipetta. Applicare una leggera pressione su una siringa da 10 cc riempita con olio minerale nella parte superiore del rubinetto a tre vie per spingere l'olio nei tubicini, nel supporto dell'ago per microiniezione e nell'ago stesso, quindi aspirare l'olio nella microssiringa.Assicurarsi di non introdurre bolle d'aria. Aspirare una bolla d'aria lunga da uno a due millimetri all'interno dell'ago. Per mantenere la separazione tra l'olio minerale e il virus, utilizzare la pompa di aspirazione per caricare con attenzione l'ago con la soluzione virale.Aspirare la soluzione in modo uniforme e lento, facendo attenzione ad evitare ostruzioni. Posizionare l'ago caricato nella posizione del micromanipolatore nell'area di iniezione, avendo cura di non romperlo sugli embrioni o sulla sonda ecografica.Spostare l'ago di iniezione in posizione, a una distanza di uno o due millimetri dalla parete uterina. A un angolo di circa 45 gradi, le immagini generate dalla sonda ecografica vengono visualizzate su un monitor video. La punta dell'ago appare come il punto più luminoso sullo schermo.Assicurarsi che la direzione dell'oscillazione della sonda sia parallela alla lunghezza dell'ago. Utilizzando l'immagine ecografica sul monitor video, posizionare l'embrione in modo che la regione bersaglio, in questo caso il quarto ventricolo cerebrale, sia chiaramente visibile e accessibile con l'ago. Allineare la regione cerebrale bersaglio con la direzione di avanzamento dell'ago.Utilizzare il micromanipolatore per portare la punta dell'ago a contatto appena con la parete uterina. Spingere rapidamente in avanti l'ago per penetrare il tessuto uterino. Potrebbero essere necessarie più punture simili per attraversare la sacca amniotica e iniettare nel cervello l'embrione con il volume appropriato di virus.In un'iniezione riuscita, una nebbia particolata entra nel ventricolo e lo spazio ventricolare può espandersi leggermente; ritirare l'ago indietro di circa cinque millimetri prima di iniettare l'embrione successivo. Dopo aver iniettato entrambi gli embrioni, utilizzare la pinzetta per tirare i due embrioni successivi attraverso la membrana schiastica e reinserire gli embrioni iniettati nell'addome. Una volta iniettato il numero desiderato di embrioni e reinseriti nella cavità addominale, spostare il topo fuori dallo stadio di iniezione e su un tampone assorbente.Per chiudere l'incisione, lasciare l'animale riprendere conoscenza in una gabbia pulita e riscaldata. Questa immagine catturata da un'ecografia in tempo reale di un embrione di topo a E 9,5 mostra diverse caratteristiche anatomiche che possono essere utilizzate per guidare le iniezioni. Qui V indica il ventricolo, s l'amnios e uw la parete uterina.L'ago di iniezione è il punto luminoso a destra dell'immagine. In questa immagine, un embrione iniettato con un virus esprimente A-P-L-A-P mostra cellule infette dal virus di colore positivo per PLAP all'interno del cervello in via di sviluppo. Diverse settimane dopo l'infezione, l'espressione del marcatore consente l'esame della morfologia cellulare e della posizione delle cellule, nonché un'analisi clonale.È stato appena mostrato come eseguire un'iniezione microscopica guidata da ultrasuoni di un vettore retrovirale in embrioni di topo in utero al giorno embrionale 9,5. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di agire rapidamente, poiché la sopravvivenza è tanto più probabile quanto minore è il tempo in cui il topo viene manipolato durante l'intervento chirurgico. È inoltre importante ricordare di prestare attenzione quando si utilizzano materiali pericolosi per la salute, come i vettori retrovirali.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

ultrasound-guided-microinjection-into-mouse-forebrain-utero-at

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

In Utero iniezione intraventricolare e Elettroporazione di E15 embrioni di topo

Un metodo di trasferimento genico nel cervello del mouse di sviluppo è descritta utilizzando un metodo unico chirurgico e la forma speciale di elettrodi. Questa tecnica unica consente la trasfezione di DNA plasmidico temporalmente e spazialmente, che aiuterà molti neuroscienziati a studiare lo sviluppo del cervello.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

L'orecchio interno è un topo placode derivato il cui organo sensoriale per lo sviluppo del programma è elaborato durante la gestazione. Definiamo...

Gene Transfer per l&#39;orecchio del mouse Sviluppo Inner<em&gt; In Vivo</em&gt; Elettroporazione

Controllare l'espansione delle cellule staminali somatiche è un freno notevole loro studio e l'uso in terapia. Qui si descrive un sistema per controllare temporalmente neurale espansione delle cellule staminali durante lo sviluppo e adulta, che può essere utilizzato per aumentare il numero di neuroni generati nel cervello di topo.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Nonostante l'importanza funzionale e mediche...

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Qui, vi presentiamo un protocollo per iniettare mezzi di contrasto ecografici microbolle in vita, isolata tardo-gestazione di embrioni murini stage. Questo metodo consente lo studio dei parametri di perfusione e di marcatori molecolari vascolari all'interno dell'embrione con mdc alta frequenza ecografica.

Contrast Imaging in embrioni di topo Utilizzo ad alta frequenza Ultrasound

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

La combinazione di microscopia elettronica di trasmissione e trasduzione nell'utero è un approccio potente per studiare i cambiamenti morfologici nell'ultrastruttura bene del sistema nervoso durante lo sviluppo. Questo metodo combinato consente approfondimenti cambiamenti nei dettagli strutturali sottostanti la neuroplasticità rispetto alla loro rappresentazione topografica.

Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale

In questo protocollo, descriviamo come iniettare lentivirus nella cavità amniotica del topo a E7.5, portando a una trasduzione uniforme dell'intera piastra neurale, con effetti dannosi minimi sulla sopravvivenza o sullo sviluppo embrionale.

Targeting della placca neurale murina mediante nano-iniezione in utero (NEPTUNE) al giorno embrionale 7.5

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Impara la microiniezione guidata da ultrasuoni nel proencefalo di embrioni di topo in utero a E9.5. Questa tecnica consente la manipolazione dell'espressione genica nelle cellule della zona germinale prima della neurogenesi.

Ultrasound-Guided Microiniezione nel proencefalo mouse In Utero A E9.5

Esplora altri video