Name: Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per analisi modifica dinamica Histone nellespressione genica attivata nelle cellule umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Scopri la tecnica ChIP per analizzare le modificazioni dinamiche degli istoni durante l'attivazione dell'espressione genica mediata da STAT1 nelle cellule umane. Questo metodo consente di monitorare il reclutamento dei fattori di trascrizione.

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Questo lavoro è supportato dall&#39;Università della Virginia, l&#39;Università della Virginia Cancer Center e The F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Ringraziamo il James E. Darnell Lab (Rockefeller University), Robert Ross Lab (Fordham University) per linee cellulari.

PIANIFICAZIONE Il giorno prima di un esperimento di ChIP è previsto, le cellule devono essere coltivate in modo che un numero sufficiente è disponibile. Si supponga che ogni saggio ChIP richiederà ~ 1-1,5 x 10 7 cellule. Sempre intenzione di fare sia il negativo (IgG) e positivo (pan anticorpi istoni) controlla e ripetizione degli esperimenti. Suggerimento - Per le celle 2FTGH, ogni saggio ChIP richiede circa un 15 centimetri di tessuto piatto cultura al 80% confluenza. PARTE 1: PREPARAZIONE ED A SVOLGERE CROMATINA ChIP <ol><li> Rimuovere i supporti della cultura e indurre le cellule per i tempi richiesti con 20 ml di 10% siero di vitello cosmica (CCS) / DMEM contenente IFN-gamma a 5 ng / ml. Sostituire i supporti sui piatti uninduced con 20 ml di 10% CCS / DMEM pure. </li><li> In una cappa aspirante, aggiungere 540 microlitri di formaldeide 37% a 20 mL di media (1% di concentrazione finale) nel piatto 15 cm. Suggerimento - piastra Tilt e aggiungere la formaldeide al pool di supporti - poi placca rocciosa a diffondersi in modo uniforme. </li><li> Lasciare reticolazione a procedere per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungi glicina a 0,125 M concentrazione finale per fermare reticolazione. </li><li> Aspirare il vuoto dei media e lavare le cellule una volta con 10 ml di fosfato ghiacciata soluzione salina tamponata (PBS). </li><li> Raccogliere le cellule con un raschietto cellula ~ 7 ml di PBS e combinare le cellule (da 6 piastre) che sono stati trattati in modo identico in tubo da 50 ml su ghiaccio. </li><li> Centrifuga (Beckman Coutler Allegra 12-R centrifuga) a 1800 rpm a 4 ° C per 5 minuti e aspirare il PBS. Suggerimento - Snap congelare il pellet se fermarsi qui e conservare a -80 ° C. </li><li> Risospendere il pellet in 4 mL di tampone gonfiore (25 HEPES mM pH 7,8, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 0.1% NP40. Aggiungere 1 mM DTT, gli inibitori della proteasi completa e freddo sul ghiaccio prima dell'uso) e trasferimento a 15 mL tubo conico. Suggerimento - Questo volume tampone gonfiore è appropriato per un piatto 6 pooling (~ 6-9 x 10 7 cellule). Tampone più o meno potrebbe cambiare l'efficienza douncing. </li><li> Incubare la sospensione cellulare in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Trasferire la sospensione per un pre-raffreddata 15 ml douncer (Wheaton) e dounce 20 colpi di pestello A. </li><li> Trasferimento dounced cellule di nuovo ad un tubo da 15 ml su ghiaccio. </li><li> Centrifugare a 2500 rpm per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet nucleare (~ 200 ul da 6 piastre) in 3 ml (15 volumi pellet) di tampone di sonicazione (50 mM HEPES pH 7,9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, desossicolato di sodio 0,1%, 0,1% SDS. Aggiungi inibitori della proteasi completa e chill sul ghiaccio al momento dell'uso). Suggerimento - Questo volume tampone sonicazione è appropriato per un piatto 6 pooling (~ 6-9 x 10 7 cellule). Tampone più o meno potrebbe cambiare l'efficienza sonicazione. </li><li> Sonicare sospensione nuclei in ghiaccio per 10 cicli (20 secondi on/40 secondi dal / ampiezza impostazione di 8) usando un Sonicator Misonix 3000 equipaggiato con il microtip. Questo genere si traduce in frammenti di cromatina media 200-1000 bps nel formato. Suggerimento - Perché sonicatori varierà, l'efficienza sonicazione deve essere determinata empiricamente. Per fare questo, prendete aliquote di 20 l sonicazione prima e dopo ogni ciclo di sonicazione. Calore questi campioni a 65 ° C per 4 ore. Aggiungi il caricamento del buffer del DNA e pilotare un 1% di agarosio / TBE gel per visualizzare frammenti di DNA.) </li><li> Trasferimento sonicato materiale da un tubo SS34 centrifuga e centrifugare per 20 minuti a 4 ° C a 13000 rpm in un rotore SS34 (Sorvall RC6 Inoltre centrifuga) per far sedimentare ciò che è di solito una piccola quantità di detriti cellulari. </li><li> Con attenzione trasferire il sopranatante in una provetta da 15 ml conica sul ghiaccio. </li><li> Pre-clear con l'aggiunta di 360 microlitri sperma di salmone DNA / proteina A o G agarosio perle di liquami e dondolo a 4 ° C per almeno 30 minuti. Suggerimento - Questo passo si riduce il rumore nel saggio che deriva da eventi legame non specifico. </li><li> Centrifugare a 1000 rpm a 4 ° C per 5 minuti per far sedimentare le perline agarosio. </li><li> Trasferimento pre-cancellati surnatante in un'altra provetta da 15 ml conica sul ghiaccio. </li><li> Misurare la A260 unità di pre-cancellati cromatina e regolare il volume con tampone di sonicazione di quattro (4) A260 unità (0,2 mg / ml assumendo A260 1 unità = 0,050 mg / ml) Suggerimento - Per misurare la A260 unità, diluire 10 ml di pre-cancellati cromatina in 190 microlitri DDW; vuoto spettrofotometro con 10 microlitri di buffer sonicazione in 190 microlitri DDW. </li><li> Risparmiate il 75 microlitri della cromatina (a 4 A260 unità) come il campione di ingresso e conservare a 20 ° C fino al momento di invertire legami crociati. Suggerimento - Questo passo è fondamentale per l'analisi dei dati. Non trascurare di prendere il aliquota di ingresso. </li><li> Aliquota della cromatina pronto a 1,7 mL microcentrifuga su ice aliquote come 1 ml. Suggerimento - Se fermarsi qui, a scatto congelare la cromatina preparato in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C. NB: cromatina memorizzati possono degradare, producendo risultati non ottimali, in modo da evitare se possibile. </li><li> Aggiungere il ChIP-grade anticorpi per i campioni indotto e uninduced set in duplice copia. Aggiungi IgG (2 mg) e fondo di anticorpi istone H3 (15 mL), come i controlli negativi e positivi di indotto e uninduced set di campioni. Suggerimento - La quantità di anticorpi da utilizzare deve essere determinata empiricamente o vedere la scheda prodotto del fornitore per importi suggeriti. In genere 1-2 mg di un chip di livello anticorpale funziona bene. Il volume appropriato deve essere determinato empiricamente per gli anticorpi che vengono forniti come siero. </li><li> Roccia tutti i tubi notte a 4 ° C. </li></ol> PARTE 2: COLLECT immunocomplessi <ol><li> Aggiungere 60 ml di sperma di salmone DNA / proteina A o proteina G agarosio liquami perline di tutti i tubi. Usa Proteine ​​Suggerimento A per anticorpi policlonali di coniglio e G proteine ​​per gli anticorpi monoclonali murini. </li><li> Roccia a 4 ° C per almeno 60 minuti. </li><li> Agglomerare le immunocomplessi (perline agarosio) da microfuging gentilmente a 2000 rpm a 4 ° C per 3 minuti. </li><li> Aspirare il sopranatante. </li><li> Lavare le immunocomplessi con 1 ml di ciascuna delle seguenti tamponi di lavaggio per 10 minuti con dondolo a 4 ° C. Microcentrifuga per 3 minuti a 2000 rpm a 4 ° C tra ogni lavaggio e aspirare il surnatante. Conservare i campioni refrigerata sul ghiaccio. Aggiungi PMSF appena prima dell'uso. <ul><li> Sale a basso Wash - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li> Sale alta Wash - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF </li><li> LiCl Wash - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, desossicolato di sodio 1%, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM PMSF </li><li> Lavare TE - due lavaggi con tampone TE -10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF </li></ul></li><li> Rimuovere il tampone di lavaggio finale TE e ai talloni, aggiungere 500 microlitri tampone di eluizione (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS). Suggerimento - Il tampone di eluizione devono essere preparate al momento. </li><li> Vortice di mescolare perle di agarosio in tampone di eluizione e calore per 30 minuti a 65 ° C. Suggerimento - vortice ciascun tubo almeno ogni 10 minuti durante il 30 minuti. </li><li> Microcentrifuga per 30 secondi a 2000 rpm e trasferire il eluente in una provetta da microcentrifuga nuovo. Suggerimento - Durante l'eluizione, scongelare i campioni di ingresso e aggiungere 500 microlitri tampone di eluizione a ciascuno. Includere questi campioni in tutti i passaggi per il futuro. </li><li> Aggiungere 5 M di NaCl ad una concentrazione finale di 200 mm a tutti i campioni e vortice. </li><li> Incubare a 65 ° C per una notte (o almeno 4 ore). </li></ol> PARTE 3: ChIP'd purificare e DNA INGRESSO <ol><li> Microcentrifuga tutti i campioni per 30 secondi per la raccolta della condensa sui coperchi. </li><li> Aggiungere 1ml di RNasi A (10 U / mL) a ciascuna provetta ed incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. </li><li> Aggiungere 10 L 0,5 M EDTA, 40 microlitri 0,5 M Tris-Cl pH 6,5, 2 microlitri proteinasi K (10 mg / ml) e incubare a 45 ° C per 60 minuti. Suggerimento Preparare una master mix di questi reagenti e aggiungere 52 microlitri per ogni provetta. </li><li> Fenolo / cloroformio / alcool isoamilico estrarre e poi cloroformio / alcool isoamilico estrarre i campioni. </li><li> Aggiungere 2 glicogeno microlitri (25 mg / mL) e 0,1 volumi di acetato di sodio 3M pH 5.2 e vortice. </li><li> Aggiungere 2,5 volumi di etanolo 100% e vortice. </li><li> Incubare a 20 ° C durante la notte. </li></ol> PARTE 4: ChIP'd purificare e DNA INGRESSO CONTINUATO <ol><li> Campioni microcentrifuga per un minimo di 20 minuti a 13000 rpm a 4 ° C per precipitare il DNA / glicogeno pellet. </li><li> Lavare con DNA / glicogeno pellet con 1 ml di etanolo al 70%. </li><li> Aria secca il pellet o rapidamente a secco in centrifuga DNA vuoto velocità Savant. Suggerimento - Non troppo secco il DNA. </li><li> Risospendere DNA / glicogeno pellet in 200 microlitri tampone TE. </li><li> DNA (1 mL) è pronto per la quantificazione tramite real-time PCR. Conservare il DNA rimanente a 20 ° C. Suggerimento - Utilizzo di più di 1 ml di DNA possono inibire la real-time PCR, in modo da scalare con cautela. </li></ol> Parte 5: I RISULTATI DI RAPPRESENTANZA: Campioni di DNA ChIP e ingresso sono quantificati con Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Veloce Real-Time PCR System) utilizzando primers specifici per il locus genico di interesse. Primer che genomica sequenza bersaglio noto per essere arricchito in o privi di modificazioni degli istoni essere analizzati possono essere utilizzati come controlli positivi e negativi. I dati sono presentati come percentuale di ingresso. La procedura di chip dovrebbe essere interamente repeated con tre repliche biologiche per garantire cambiamenti riportati in modificazioni degli istoni sono statisticamente significative. Ci sono diversi aspetti importanti da considerare quando si utilizzano real-time PCR per quantificare il DNA, compresa la progettazione primer, l'efficienza della PCR, e il modo appropriato per calcolare la percentuale di procedure di ingresso e di normalizzazione. Quando il profiling di occupazione degli istoni modifica attraverso un gene, l'efficienza della PCR devono essere coerenti tra tutte le coppie di primer. Il real-time PCR produttore del sistema in grado di fornire le informazioni necessarie e di formazione. La figura 1 mostra i risultati rappresentante della cromatina durante immunoprecipitato STAT1 l'attivazione del gene IRF1 9, innescato da IFN-γ. <img src="/files/ftp_upload/2053/2053fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Occupazione di STAT1, RNA polimerasi II e H3K36me3 è dinamico durante STAT1 attivazione del gene IRF1. (A, B, C) ​​ChIP con α-H3K36me3, α-STAT1 e α-Pol II della cromatina delle cellule raccolte da 2FTGH indotta con IFN-γ per 30 minuti (quadrati rossi), 1,5 ore (cerchi blu), 5 ore ( triangoli verdi) o uninduced (diamanti neri). IgG è il controllo negativo (grigio croci). (D) Pan H3 è un controllo positivo e mostra l'occupazione degli istoni attraverso il locus in indotta (cerchi blu) e le condizioni uninduced (diamanti neri). Il tuffo il -5 bp è dovuto all'esaurimento nucleosoma che si trova nei siti di inizio della trascrizione.

<ol><li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling%3A+Stats%3A+transcriptional+control+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li>
<li>Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li>
<li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma%3A+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
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<li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li>
<li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo ChIP delineato è stato utilizzato con successo in laboratorio per analisi più di venti differenti modificazioni degli istoni. Inoltre, abbiamo caratterizzato i cambiamenti nella occupazione dei fattori di trascrizione, enzimi che modificano gli istoni, proteine ​​che riconoscono modificazioni degli istoni e la RNA polimerasi II macchinario di trascrizione, in diverse IFN-γ geni indotti. Abbiamo anche utilizzato la procedura per caratterizzare cambiamenti modificazioni degli istoni durante la differenziazio...

<table><tbody><tr><td>Formaldeide al 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio/alcol isoamilo</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>Inibitori completi della proteasi Mini</td><td>Roche Group</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>Siero di vitello cosmico</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Etilene</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Roche Group</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>Roche Group</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gamma</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Sale sodico dell'acido deossicolico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-istone H3, CT, pan</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo/cloroformio/isoamile</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>DNA di sperma di salmone/agarosio Protein A</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>DNA di sperma di salmone/agarosio Protein G</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-STAT1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA polimerasi II</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprecipitazione della cromatina (chip) per analisi modifica dinamica histone nell&#39;espressione genica attivata nelle cellule umane

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In risposta ad una varietà di ligandi extracellulari, la STAT (trasduttori di segnale e attivatore della trascrizione) fattori di trascrizione sono rapidamente reclutati dal loro stato latente nel citoplasma ai recettori della superficie cellulare dove vengono attivati ​​da fosforilazione in un singolo residuo tirosina 1. Poi dimerizzano e traslocare al nucleo di guidare la trascrizione dei geni bersaglio, incidono sulla crescita, differenziamento, l&#39;omeostasi e la risposta immunitaria. Non sorprende, dato il loro coinvolgimento nei processi di diffusione delle cellule normali, disregolazione della funzione STAT contribuisce alla malattia umana, in particolare per i tumori 2 e malattie autoimmuni 3. E &#39;ben noto che la trascrizione è regolata da alterazioni al modello cromatina 4,5. Queste alterazioni includono le attività di ATP-dipendente complessi, così come modifiche covalenti degli istoni e la metilazione del DNA 6. Poiché l&#39;attivazione STAT dell&#39;espressione genica è sia rapido e transitorio, richiede meccanismi specifici per la modulazione del modello cromatina a STAT-dipendenti loci genici. Per definire questi meccanismi, ci caratterizzano le modificazioni degli istoni e le attività enzimatiche che li generano a loci genici che rispondono alle STAT segnalazione. Questo protocollo descrive immunoprecipitazione della cromatina, un metodo che è prezioso per lo studio di STAT segnalazione alla cromatina nell&#39;espressione genica attivata.

Questo protocollo descrive come immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è usato per studiare le alterazioni dinamiche al modello cromatina che regolano la trascrizione indotto da una via di trasduzione del segnale.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per analisi modifica dinamica Histone nell&#39;espressione genica attivata nelle cellule umane

In risposta a una varietà di ligandi extracellulari, i fattori di trascrizione STAT (trasduttore del segnale e attivatore della trascrizione) vengono rapidamente reclutati...

L'esperimento con il chip viene utilizzato per monitorare i cambiamenti dinamici nelle modifiche istoniche che si verificano durante l'espressione genica attivata da STAT1. Inoltre, in questo modo è possibile analizzare le alterazioni nell'occupazione dei fattori di trascrizione, dei complessi modificatori degli istoni e dello stesso apparato di trascrizione. Per iniziare il saggio, le cellule vengono indotte con interferone gamma per attivare la via di segnalazione di STAT1; successivamente le cellule vengono incrociate con formaldeide e raccolte. Procedere quindi all'isolamento dei nuclei e alla sonicazione, che frammenta la cromatina in pezzi di circa 200-1000 paia di basi. Successivamente, aggiungere un anticorpo specifico per la proteina o la modifica istonica di interesse, quindi precipitare i complessi immuno-specifici.I complessi immunitari vengono lavati, i legami incrociati sono invertiti e il DNA viene purificato. I cambiamenti nelle modificazioni istoniche o il reclutamento di proteine in aree specifiche di un gene possono essere determinati mediante analisi quantitativa di PCR in tempo reale del DNA immuno-precipitato. Ciao, mi chiamo Lauren Borow del laboratorio della dottoressa Melissa Hendrickson e del Dipartimento di Biologia dell'Università della Virginia.Oggi vi mostreremo una procedura per l'immunoprecipitazione della cromatina. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le modifiche istoniche dinamiche che si verificano durante la trascrizione a valle della segnalazione di STAT1. Cominciamo dunque.Un giorno prima di iniziare questa procedura, coltivare la cellula in modo da avere un numero sufficiente disponibile per le due cellule FTGH utilizzate qui. Preparare una piastra da coltura tissutale da 15 centimetri al 80% di confluenza per ogni saggio con chip. Includere in ogni esperimento un controllo negativo con IgG, un controllo positivo con anticorpo pan-istone e duplicati.Per iniziare questa procedura, rimuovere il mezzo di coltura. Sostituirlo con 20 millilitri di DMEM integrato con il 10% di siero di vitello cosmico e contenente interferone gamma a cinque nanogrammi per millilitro. Inoltre, sostituire il mezzo sulle piastre non indotte con 20 millilitri di C-C-S-D-M-E-M al 10%.Proseguire quindi sotto cappa. Inclinare la piastra per colture cellulari da 15 centimetri e aggiungere 540 microlitri di una soluzione di formaldeide al 37% a 20 millilitri di mezzo. Quindi agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente.Lasciare avvenire la reazione di cross-linking per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere glicina fino a una concentrazione finale di 125 millimolare per arrestare la reazione di cross-linking. Aspirare sotto vuoto il mezzo e lavare le cellule una volta con 10 millilitri di PBS freddo sul ghiaccio, utilizzando una spatola per cellule; raccogliere le cellule in circa sette millilitri di PBS e unire le cellule trattate in modo identico provenienti da sei piastre da 15 centimetri in un tubo conico da 50 millilitri posto sul ghiaccio.Infine, centrifugare le cellule raccolte a 1.800 giri/min per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed aspirare il PBS. Se si interrompe qui, congelare rapidamente la sospensione cellulare e conservarla a meno 80 gradi Celsius dopo il cross-linking. Il passaggio successivo consiste nel preparare la cromatina.Iniziare aggiungendo DTT uno millimolare e inibitori completi delle proteasi al buffer di gonfiamento raffreddato in ghiaccio. Ri-sospendere il pellet proveniente da sei piastre in quattro millilitri di buffer di gonfiamento e trasferire in una provetta conica da 15 millilitri. L'uso di una quantità maggiore o minore di buffer potrebbe alterare l'efficienza del dancing.Incubare la sospensione cellulare sul ghiaccio per 10 minuti. Al termine dell'incubazione sul ghiaccio, trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 millilitri pre-raffreddato e omogenizzare. Eseguire 20 passaggi con il pestello A; dopo l'omogenizzazione, trasferire nuovamente le cellule in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare sul ghiaccio a 2.500 giri/min per cinque minuti a quattro gradi Celsius, quindi eliminare il soprannatante lasciando il pellet nucleare.Aggiungere inibitori completi della proteasi al tampone di sonificazione raffreddato su ghiaccio. Sei piastre forniscono circa 200 microlitri di sospensione del pellet nucleare. Sospendere il pellet in 15 volumi di pellet o in tre millilitri di tampone di sonificazione.L'utilizzo di un volume diverso per questa quantità di cellule potrebbe modificare l'efficienza della sonica. L'efficienza della sonica dovrebbe essere determinata in anticipo per l'ator del vostro laboratorio. In questo caso viene utilizzato un Miss Sonic sonicate 3000 dotato di microchip.Sonicare la sospensione dei nuclei sul ghiaccio per 10 cicli di 20 secondi accesi e 40 secondi spenti, con un'ampiezza impostata a otto. Questo di solito produce frammenti di cromatina con una dimensione media compresa tra 200 e 1000 paia di basi al termine della sonicazione. Trasferire il materiale sonificato in un tubo per centrifuga SS 34 e centrifugare a 13.000 giri/min per 20 minuti a quattro gradi Celsius.In un rotore SS 34, centrifugare per formare un pellet di detriti cellulari, che di solito è una piccola quantità. Trasferire con attenzione il sopranatante in un tubo conico da 15 millilitri posto sul ghiaccio. Procedere con la cromatografia per ridurre il fondo derivante da eventi di legame non specifico.Prima di tutto, pre-pulire il preparato di cromatina aggiungendo 360 microlitri di sospensione di perle di agarosio con DNA di sperma di salmone e proteina A o G, quindi agitare a 4 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Centrifugare a 1000 giri al minuto per cinque minuti a 4 gradi Celsius per formare il pellet delle perle di agarosio. Successivamente, trasferire il sopranatante pre-pulito in un altro tubo conico da 15 millilitri posto sul ghiaccio.Successivamente, misurare l'assorbanza a 260 nanometri o le unità A 260 della cromatina. Diluire 10 microlitri di cromatina preclusa in 190 microlitri di acqua bidistillata. Come bianco, mescolare 10 microlitri di buffer di sonificazione con 190 microlitri di acqua bidistillata.Regolare il volume del campione con il buffer di sonica fino a raggiungere quattro unità A 260. Conservare 75 microlitri di cromatina pre-purificata a quattro unità A 260 come campione di input e conservare a meno 20 gradi Celsius fino al momento di invertire i legami incrociati. Ricordare che questo passaggio è cruciale per l'analisi dei dati.Quindi, non trascurare di prelevare l'aliquota iniziale e distribuire il resto della preparazione di cromatina in aliquote da un millilitro in provette microcentrifuga da 1,7 millilitri, ponendole sul ghiaccio. Se ci si ferma qui, congelare rapidamente il cromatina preparato in ghiaccio secco e conservare a meno 80 gradi Celsius.Tuttavia, poiché la cromatina conservata può degradarsi, è preferibile proseguire immediatamente con l'ip. Aggiungere ora gli anticorpi di qualità chip ai set di campioni indotti e non indotti, in duplicato.Generalmente funziona bene da uno a due microgrammi di anticorpo, ma la quantità deve essere determinata empiricamente in precedenza. Aggiungere due microgrammi di IgG e 15 microlitri di anticorpo pan istone H tre come controlli negativo e positivo ai campioni indotti e non indotti. Inoltre, agitare delicatamente tutti i tubi tutta la notte a quattro gradi Celsius prima di procedere all'isolamento dei complessi immuno-precipitati dopo l'incubazione notturna con gli anticorpi.Aggiungere 60 microlitri di sospensione di perle di DNA di sperma di salmone con proteina A o proteina G a tutti i tubi. Incubare a quattro gradi Celsius per almeno 60 minuti per legare i complessi immunitari alle perle.Centrifugare delicatamente a 2000 g per tre minuti a quattro gradi Celsius i complessi immuno legati alle perle di agarosio, quindi aspirare il soprannatante. Successivamente eseguire una serie di lavaggi con tampone, iniziando con un lavaggio a bassa forza ionica, seguito da un lavaggio ad alta forza ionica. Quindi effettuare un lavaggio con cloruro di litio.E infine, due lavaggi con TE per ciascuno dei tamponi di lavaggio. Aggiungere PMSF immediatamente prima dell'uso, lavare con un millilitro di tampone per 10 minuti con agitazione orizzontale a 4 gradi Celsius, centrifugare per tre minuti a 2000 giri al minuto a 4 gradi Celsius ed aspirare il soprannatante mantenendo i campioni freddi sul ghiaccio. Dopo aver rimosso l'ultimo lavaggio con tampone TE, aggiungere 500 microlitri di tampone Lucian appena preparato alle perle, vortexare per mescolare le perle aros nel tampone Lucian e incubare a 65 gradi Celsius per 30 minuti.Vortexare ogni 10 minuti durante l'eluzione dei campioni, scongelare i campioni di input e aggiungere 500 microlitri di tampone di eluzione a ciascuno. Includere questi campioni in tutti i passaggi successivi. Una volta completata l'incubazione a 65 gradi Celsius, microfondere ogni 30 secondi a 2000 giri al minuto e trasferire l'EENT in una nuova provetta da microcentrifuga.Infine, invertire il cross-linking. Aggiungere cloruro di sodio 5 M a una concentrazione finale di 200 millimolari in tutti i campioni e vortexare nell'incubatrice a 65 gradi Celsius per almeno quattro ore fino a tutta la notte. Una volta che i legami crociati dei complessi immunitari sono stati invertiti, il DNA legato può essere recuperato al termine dell'incubazione a 65 gradi Celsius.Centrifugare i campioni micro in fuge per 30 secondi. Per raccogliere la condensa sui tappi, aggiungere un microlitro di RNAsa a ogni provetta e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti successivamente al trattamento con RNAsa in ogni provetta con 10 microlitri di EDTA 0,5 M, 40 microlitri di cloruro di tris 0,5 M pH 6,5 e due microlitri di proteinasi K, per un totale di 52 microlitri da un mix master, e incubare a 45 gradi Celsius per 60 minuti. Estrarre i campioni con fenolo cloroformio, alcol isoamilico, e successivamente con cloroformio alcol isoamilico.Quindi, per precipitare il DNA, aggiungere due microlitri di glicogeno e 0,1 volumi di acetato di sodio tre molare, pH 5,2, a ciascun campione, vortexare, aggiungere 2,5 volumi di etanolo al 100%, vortexare nuovamente e incubare a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Recuperare i campioni e centrifugare a 13.000 giri al minuto per 20 minuti a quattro gradi Celsius.Lavare i pellet di glicogeno del DNA con un millilitro di etanolo al 70% e aria. Asciugare i pellet o utilizzare una centrifuga a vuoto rapido. Non eccessivamente disidratare il DNA; risospendere i pellet in 200 microlitri di tampone TE e quantificare non più di un microlitro mediante PCR in tempo reale.I risultati della PCR mostrati qui provengono da un esperimento con chip che analizza la dinamica di H three K 36 ME three. Durante l'induzione dell'interferone gamma del gene IRF one, è stato utilizzato un anticorpo contro H three K 36 ME three per immunoprecipitare la cromatina raccolta da cellule FTGH trattate con interferone gamma per 30 minuti, 1,5 ore e 5 ore, utilizzando IgG come controllo negativo. L'occupazione di STAT one è stata inoltre determinata in questi stessi intervalli di tempo, così come l'occupazione della RNA polimerasi two.L'occupazione delle istoni attraverso il locus del gene IRF1 è stata determinata nelle condizioni non indotte e indotte utilizzando l'anticorpo pan-istone H3, che funge anche da controllo positivo. La diminuzione attorno a meno cinque paia di basi è dovuta alla carenza di nucleosomi che si riscontra nei siti di inizio della trascrizione. È stato appena illustrato il procedimento per l'immunoprecipitazione della cromatina.Questo saggio è utile per osservare le modifiche della cromatina che si verificano durante la trascrizione genica attivata. Quando si esegue questa procedura, è importante ottimizzare il protocollo di frammentazione della cromatina con il proprio ator prima di iniziare un esperimento di chip. Ricordarsi inoltre di prelevare i campioni di input.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per analisi modifica dinamica Histone nell'espressione genica attivata nelle cellule umane

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