Name: Come la cultura, record e stimolare reti neuronali sulla micro-array di elettrodi (MEA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Impara a coltivare, registrare e stimolare reti neuronali su micro-array di elettrodi (MEA) per studiare attività di rete e plasticità sinaptica in vitro. Questo protocollo dettagliato utilizza neuroni corticali di ratto.

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Vorremmo ringraziare i membri del gruppo di Potter per fornire preziosi commenti sul protocollo. Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio clinico di formazione alla ricerca presso l&#39;Accademia Americana di Neurologia della Fondazione a CMH, una borsa di studio presso l&#39;Istituto Nazionale di General Medical Sciences (NIGMS; <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> ) a JDR (GM08169 ), una borsa di studio del National Institute of NIH Neurological Disorder and Stroke (NS054809), un Ruth L. Kirschstein Nazionale Servizio Research Award per JDR (NS060392), un NSF Efri borsa (0.836.017), il Premio Fondazione per la Ricerca Traslazionale Coulter, e un borsa di studio di ricerca traslazionale per JDR (NS007480).

<ol><li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li>
<li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+thick+brain+slices%3A+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li>
<li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst+Rehabil+Eng%22%5BJournal%5D)">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li>
<li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li>
<li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays%3A+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li>
<li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+%281-42%29+peptide+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li>
<li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li>
<li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density%3A+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li>
<li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li>
<li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Microsc+Suppl%22%5BJournal%5D)">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li>
<li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays%2C+with+real-time+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li>
<li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).</li>
</ol>

CMH non ha nulla da rivelare.<br /&gt; JDR e SMP sono pagati consulenti per Axion Biosystems.<br /&gt; Le tasse di presentazione e le spese di elaborazione video per questo articolo e il video sono stati gentilmente sponsorizzato da sistemi multi-canale.

Questo protocollo mostra le istruzioni su come la cultura e mantenere reti neuronali su micro-array di elettrodi e come introduzione alla registrazione da reti neuronali e stimolante. Alcuni dei problemi più comuni quando si registra da MEA sono stati discussi anche nella sezione MEA risoluzione dei problemi. Ci sono variazioni occasionali nel protocollo come discusso in tutto e spesso questi cambiamenti sono utilizzati per ottimizzare le condizioni specifiche richieste da parte di alcuni progetti sperimentali. Anche se il sistema di registrazione e stimolante qui presentata è composta della nostra progettato NeuroRighter 15 con il preamplificatore MCS, ci sono più altri sistemi in grado di fornire una interfaccia con le reti neuronali. La scelta di un particolare impostazione dipenderà dalle specifiche esigenze sperimentali. Registrazione semplicistica e stimolazione esempi sono stati forniti in questo protocollo tuttavia queste culture su MEA possono essere utilizzati per fornire indicazioni su questioni complesse attività sinaptica e la connettività di rete neuronale. Come accennato in precedenza, i lavori in corso sta utilizzando questa tecnologia per studiare processi come la plasticità cellulare, lo sviluppo, eccitotossicità e neurodegenerazione. 6-10 Ad esempio, una recente pubblicazione dal nostro laboratorio hanno mostrato obiettivo riproducibile regia di apprendimento in vitro in tempo reale la stimolazione a circuito chiuso in risposta alle attuali attività di rete neuronale 3. Anche se le culture MEA sono spesso schizzinosi e delicati, grazie alla loro semplicità e accessibilità (rispetto agli animali intatti), forniscono un potente modello per studiare l&#39;attività neuronale a livello di rete.

Forniture <ul><li> Monouso per bottiglie filtro (150ml, 0.2μm dimensione dei pori; Nalgene # 565-0020) </li><li> Embrionale giorno 18 tempo gravide di ratto femmina </li><li> Array di microelettrodi (vedi descrizione nel protocollo, B1) </li><li> Microelettrodo coperchi array (vedi descrizione nel protocollo, B3) </li><li> Nylon cellule filtro (40μm, BD Falcon, # 352340) </li><li> Provette coniche in polipropilene (sterile, 15 ml) </li><li> Polistirolo piastre di Petri (sterile, 35mm e 100x15mm) </li><li> Puntali (sterile, 20μl, 200μl e 1000μl) </li><li> Pipette sierologiche (5ml) </li></ul> Attrezzatura: <ul><li> Biologici di sicurezza armadio / cappa a flusso laminare </li><li> Contatore di cellule </li><li> Centrifuga </li><li> Contenitore di ghiaccio </li><li> Dissezione forbici e pinze (sterilizzato) </li><li> Dissezione microscopio in una cappa a flusso laminare </li><li> Portatile elettrico Pipetman </li><li> Emocitometro </li><li> Isofluorane e delle camere a gas </li><li> Microscopio ottico </li><li> Pipetman palmare (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) </li><li> MEA sistema di registrazione (vedi descrizione nel protocollo, D1) </li><li> Roditori Ghigliottina </li><li> Tri-incubatore di gas (vedi descrizione nel protocollo, B15) </li><li> Fiasco vuoto con aspiratore collegato al cofano </li><li> Vortice </li><li> Acqua del bagno (35-37 ° C) </li></ul> Soluzioni e reagenti: BSA soluzione: Fare 5% di BSA (Sigma A-9418) in tampone fosfato salino a pH 7,4 e filtrata a 0.2μm. Questa soluzione può essere preparata in anticipo e conservato a 4 ° C per diversi mesi. Cell Media: Unire 90 ml Dulbecco modificato Eagle medio (Irvine Scientific 9024), 10 ml di siero di cavallo (Gibco 16.050), il piruvato di sodio 1 ml (100mM, Gibco 11.360), 250 microlitri GlutaMAX (Gibco 35.050), e l&#39;insulina (concentrazione finale di 2,5 mcg / ml, sigma I-5500) poi passare attraverso un 0,2 micron filter.22 Caldo ed equilibrare il medium delle cellule nell&#39;incubatore prima dell&#39;uso. Soluzione dissezione per la preparazione della soluzione papaina: 23 <table border="1"><tr><td> Dissezione soluzione (100 ml stock) </td><td> Combina in ordine, filtro 0,22 micron e conservare a 4 ° C. </td><td></td></tr><tr><td> Componente </td><td> Ml di volume </td><td> Concentrazione finale (mM) </td></tr><tr><td> Acqua bidistillata </td><td> 91,175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0,58 </td><td> 5,8 mm </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 0,025 </td><td> 0,25 mm </td></tr><tr><td> 0,5 M HEPES </td><td> 0,32 </td><td> 1,6 mm </td></tr><tr><td> 0,5% rosso fenolo </td><td> 0,2 </td><td> (0,001%) </td></tr><tr><td> 0,1 N NaOH </td><td> 0,2 </td><td> 0,2 mm </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4,5 </td><td> 90 mm </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3,0 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> 0,1 M Kynurenic acido </td><td> 1,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 mM APV </td><td> 1,0 </td><td> 0,05 mm </td></tr></table> Questa soluzione può essere preparata in anticipo e conservato a 4 ° C per diversi mesi. DNAsi I: Invitrogen (# 18047019). Aliquote di 50μl sono istantaneamente congelati e conservati a -80 ° C. Un&#39;aliquota viene scongelato in cappa a flusso laminare prima di iniziare il processo di dissociazione delle cellule. Sale di Hank soluzione equilibrata: Sigma (# 4891). Una soluzione 1X viene preparato in acqua deionizzata, sterile filtrata a 0.2μm e conservato a 4 ° C. Hibernate soluzione: Preparare il giorno di coltura. Unire 98 ml L-15 di media (Invitrogen 11.415) con 2 ml di B-27 supplemento (50X, Invitrogen # 17504) e filtro a 0,2 micron. Laminina soluzione: Preparare il giorno di coltura. Diluire 20μl di laminina (1mg/ml, Sigma L-2020) nel 980 microlitri di cellule medio per una concentrazione finale di 0.02mg/ml. Aliquote da 20 microlitri della laminina (1mg/ml) sono conservati a -80 ° C e scongelati al momento dell&#39;uso. Scongelamento deve avvenire sul banco e non nel bagno d&#39;acqua come un rapido disgelo a volte può portare a gelificazione della laminina. Papaina soluzione: 23 Calda 10 ml di soluzione di dissezione (sopra) a 30-32 ° C. Aggiungere 200 unità papaina (Sigma P-4762) e 1,6 mg L-cisteina (Sigma C-7880). Regolare il pH a 7,4 con circa 14 ml di 0,1 N NaOH. Incubare per circa 30 minuti fino a quando la soluzione clorecchie, filtro 0,2 micron, congelare flash con azoto liquido a 2 ml in 15 ml di polipropilene fiale sterili conica e conservare a -80 ° C. Scongelare una aliquota a 35-37 ° C prima di iniziare il protocollo. Polyethyleneimine (PEI) soluzione: 13 100 l di PEI (50% w / v, Sigma P-3143) viene diluito in 100 ml di tampone borato di sodio (0,1 M pH 8,4, Sigma B-9876) per una concentrazione finale di 0,05% w / v. Filtro sterile a 0,2 micron. Questo può essere preparato in anticipo e conservato a 4 ° C per mesi. Sterile acqua deionizzata: Autoclave e lasciare raffreddare a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Tripsina (0,25% con EDTA, Gibco 25200): Aliquote da 1 ml sono istantaneamente congelati e conservati a -80 ° C. Aliquote sono scongelati nel I ° 35-37 bagnomaria C prima dell&#39;uso.

come la cultura, record e stimolare reti neuronali sulla micro-array di elettrodi (mea)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

Per tutto il secolo scorso, i neuroscienziati di tutto il mondo hanno dedicato la loro vita per comprendere come le reti neurali funzionano e perché smettere di lavorare in varie malattie. Gli studi hanno incluso l&#39;osservazione neuropatologici, la microscopia a fluorescenza con etichettatura genetica, e la registrazione intracellulare nei neuroni sia dissociato e preparati fetta. Questo protocollo descrive un&#39;altra tecnologia, che coinvolge sempre più dissociato culture neuronali su micro-array di elettrodi (detti anche multi-array di elettrodi, MEA). Ci sono molteplici vantaggi di utilizzare questo sistema rispetto ad altre tecnologie. Dissociato culture neuronali su tali accordi forniscono un modello semplificato, in cui l&#39;attività di rete può essere manipolato con sequenze di stimolazione elettrica attraverso elettrodi multipli dell&#39;array. Perché la rete è piccola, l&#39;effetto della stimolazione è limitata ad aree osservabile, che non è il caso di preparati intatto. Le cellule crescono in un monostrato apportare modifiche nella morfologia facile da monitorare con varie tecniche di imaging. Infine, le culture su MEA può sopravvivere per oltre un anno in vitro che rimuove le limitazioni di tempo chiaro inerenti alle tecniche di coltura di altri 1. Il nostro laboratorio e altri in tutto il mondo stanno utilizzando questa tecnologia di porre domande importanti su reti neuronali. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire le informazioni necessarie per l&#39;impostazione, la cura, la registrazione e stimolando elettricamente culture in AAM. Nelle reti in vitro forniscono un mezzo per porre fisiologicamente questioni rilevanti a livello di rete e livello cellulare che porta ad una migliore comprensione di funzione e disfunzione cerebrale.

Questo protocollo fornisce le informazioni necessarie per l&#39;impostazione, la cura, la registrazione e stimolando elettricamente culture su MEA.<em&gt; In vitro</em&gt; Le reti forniscono un mezzo per porre fisiologicamente questioni rilevanti a livello di rete e livello cellulare che porta ad una migliore comprensione della funzione cerebrale e la disfunzione.

Come la cultura, record e stimolare reti neuronali sulla micro-array di elettrodi (MEA)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di coltivare, registrare e stimolare reti neuronali su array di micro elettrodi. Ciò si ottiene preparando prima i reagenti e gli array di microelettrodi per la coltura. Il secondo passo della procedura consiste nel dissociare i neuroni corticali da un embrione di ratto del giorno 18.La terza fase della procedura consiste nel placcare i neuroni su array di microelettrodi e la coltura per due o tre settimane. La fase finale della procedura consiste nell'sperimentare le reti neuronali attraverso la stimolazione e la registrazione dagli array di microelettrodi. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un'attività spontanea e evocata dallo stimolo nelle reti neuronali con software di registrazione e stimolazione attraverso una meticolosa coltura cellulare su array di microelettrodi.Salve, sono il professor Steve Potter. Sono il direttore del Laboratorio di Neuro Ingegneria presso il Dipartimento di Cultura di Ingegneria Biomedica presso la Georgia Tech. Questo dipartimento è condiviso con la Emory University School of Medicine.E io sono Chad Hales, un postdoc nel laboratorio del Dr. Potter. Sono anche un ricercatore cognitivo comportamentale presso il Dipartimento di Neurologia della Emory University School of Medicine. Oggi vi mostreremo come coltivare e prendersi cura dei neuroni su array multi-elettrodo.Come questi. Li usiamo per studiare l'apprendimento e la memoria in vitro e per l'elaborazione delle informazioni in rete. Quindi iniziamo In una cappa a flusso laminare, inizia a preparare il sistema multicanale micro electrode array o la pipetta MEA da 100 microlitri di polietilene ammina al centro di un MEA pulito e sterile che riposa in una piastra di Petri da 100 millimetri per evitare di danneggiare gli elettrodi.Non toccare mai oggetti solidi sulla superficie MEA. Coprire leggermente la capsula con un coperchio sterile dotato di una membrana in teflon permeabile ai gas e incubare nella cappa per 30 minuti. Il coperchio della membrana in teflon garantisce lo scambio gassoso con un'evaporazione minima e la capacità di coltura in ambienti a bassa umidità.La minore umidità consente l'uso di componenti elettronici delicati nell'incubatrice e riduce i tassi di contaminazione. Aspirare il PEI, sciacquare il MEA tre volte con uno o due millilitri di acqua deionizzata sterile. Lasciarli asciugare con il coperchio tolto nella cappa per almeno 30 minuti o fino a quando non sono completamente asciutti.Completare una dissociazione del neurone corticale E 18 come descritto nella parte di testo di questo protocollo. Filtrare le cellule dopo averle filtrate. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri e portare il volume della sospensione cellulare a quattro millilitri con un terreno cellulare con attenzione.Stendere 500 microlitri di una soluzione al 5% di BSA sotto la centrifuga in sospensione cellulare a 200 Gs per sei minuti. Mentre le celle girano, controlla che il MEA sia completamente asciutto. Pipettare con cura 20 microlitri di soluzione laminata al centro del MEA.Evitare l'introduzione di bolle d'aria e assicurarsi che tutti gli elettrodi siano coperti. Posizionare delicatamente il coperchio in teflon sul MEA per evitare l'evaporazione della laminina. Il MEA deve essere posizionato su una superficie completamente piana quando viene posizionato il coperchio.In caso contrario, la pressione potrebbe rompere il fondo di vetro dell'array. Incubare la capsula a 35-37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, 9% di ossigeno e 65% di umidità per 20 minuti. Ora trasferisci le celle filate nella cappa.Un pellet di cella dovrebbe essere visibile sul fondo del tubo. Rimuovere e mettere da parte il surnatante in caso di pellettatura incompleta. Risospendere delicatamente il pellet.Contare il numero di cellule in 10 microlitri di sospensione su un emocitometro e diluire la sospensione alla concentrazione desiderata. Tipicamente da 1000 a 3000 cellule per microlitro con terreno cellulare. Al termine dell'incubazione del laminato dell'array, aspirare immediatamente la gocciolina.Pipettare da 15 a 20 microlitri di sospensione cellulare sull'area rivestita di laminato del MEA. Coprite il piatto con il coperchio in teflon e mettetelo nell'incubatrice per 30 minuti. Con un microscopio a contrasto di fase, ispezionare la piastra per assicurarsi che le celle abbiano aderito e coprano tutti gli elettrodi.Se la copertura è incompleta, aggiungere altre cellule e incubare nuovamente. Inondare lentamente il piatto con un millilitro di terreno cellulare equilibrante riscaldato. Riposizionare il coperchio in teflon e rimettere il piatto nell'incubatrice per 24 ore.Il giorno dopo. Al microscopio a contrasto di fase, verificare che le cellule in coltura siano aderenti e che la quantità di detriti e la morte cellulare siano limitate con la cura e l'alimentazione adeguate. Come spiegato nel testo di accompagnamento, i neuroni coltivati in questo modo possono sopravvivere per più di un anno.Dopo due o tre settimane, le colture hanno raggiunto uno stato stazionario di attività e possono essere registrate da questo video che ora dimostrerà la registrazione con il programma di neuro scrittura personalizzato. Trasferire nuovamente la capsula nell'incubatore di registrazione a una temperatura compresa tra 35 e 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, 9% di ossigeno e 65% di umidità. Per mantenere la temperatura e il pH ideali, quando si sposta la parabola, trasportarla parallelamente al suolo ed evitare movimenti rapidi che potrebbero spostare le cellule dal substrato.Sollevare il MEA dalla parabola e posizionarlo nei sistemi multicanale. Registrazione dell'amplificatore di preem, assicurandosi di far corrispondere correttamente la massa interna con la massa dell'amplificatore di preem. Il preamplificatore è posizionato su un dispositivo di pelliccia, che funziona per dissipare il calore come descritto nel testo di accompagnamento qui, il preamplificatore è stato spostato fuori dall'incubatrice.Meglio mostrare la corretta sede del piatto. Utilizzare una salvietta inumidita con etanolo al 70% per pulire i contatti attorno al perimetro dell'array. Assicurarsi che il MEA sia posizionato correttamente più in basso e bloccare il coperchio.Utilizzare un batuffolo di cotone per allineare i contatti dell'array, se necessario. In neuro writer, scegli le impostazioni appropriate per l'esperimento. L'interruttore di registrazione deve essere sollevato.Per scrivere i dati in un file, fare clic sul pulsante di avvio per avviare la registrazione. La schermata spike ora mostrerà tracce di attività in corso e rumore di fondo con potenziali d'azione occasionali e picchi di attività. Se un elettrodo mostra troppo rumore, potrebbe esserci un pin disallineato sul coperchio del preamplificatore, un piccolo pezzo di spazzatura, una goccia di fluido, una superficie dell'elettrodo degradata o una membrana trasparente sovrapposta dal coperchio che interrompe il contatto.Controllare il perno di contatto e regolare con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% se necessario. Fare clic sulla scheda della forma d'onda del picco per modificare la visualizzazione dello schermo in modalità di rilevamento dei picchi in cui i potenziali d'azione vengono visualizzati in finestre statiche di tre millisecondi. Per stimolare la rete neuronale sul MEA, allenare l'algoritmo salpa nella scheda delle impostazioni di registrazione per limitare l'artefatto di stimolazione, attivare salpa nella scheda delle impostazioni online.Una volta avviata la registrazione, fare clic sulla scheda STEM per impostare un paradigma di stimolazione appropriato per utilizzare il programma ad anello aperto per stimolare un elettrodo e osservare le risposte nel piatto. Scegliere le impostazioni appropriate nella sezione ad anello aperto, quindi premere start. Visualizza le risposte nella scheda principale dei picchi e nella scheda delle forme d'onda dei picchi.Questo film ritrae lo sviluppo in vitro di neuroni e cellule gliali mentre crescono e formano una rete connessa su un MEA per micro elettrodi sono visibili. Questo è un grafico raster di due minuti di attività spontanea da una rete neuronale. Ogni punto nero rappresenta un potenziale d'azione.Due raffiche di attività sono indicate con le frecce blu. La risposta su più elettrodi è una funzione della connettività di rete. Ecco un grafico raster di 16 secondi di attività evocata dallo stimolo.Le stelle rosse rappresentano gli stimoli. Le frecce rosse mostrano cinque stimoli che hanno indotto con successo esplosioni di attività sinaptica attraverso più elettrodi. Occasionalmente uno stimolo non produce un'esplosione.Qui alla freccia blu, ti abbiamo appena mostrato come coltivare, registrare e stimolare reti neuronali su array di micro elettrodi. Probabilmente la cosa più importante di cui preoccuparsi è prevenire l'infezione delle colture e ridurre l'evaporazione. Se si utilizzano coperchi con membrane semipermeabili come questa, sono sigillati e prevengono l'evaporazione e l'infezione, e si potrebbe essere in grado di coltivare le colture per mesi, forse anche più di un anno.Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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Un metodo efficace per studiare valanghe neuronale, cioè scala-invarianti spazio-temporale scoppia attività, indicativa delle dinamiche condizioni critiche nella corteccia. Valanghe emergere spontaneamente nello sviluppo di strati superficiali della corteccia cerebrale in coltura che permette di misure a lungo termine delle attività con gli array planare integrata multi-elettrodi (MEA), a condizioni ben controllate.

Multi-array di elettrodi Recordings Valanghe neuronali in Culture organotipica

Questo video dimostra lo sviluppo di una coltura neuronale 3D accoppiata a un array di microelettrodi planari con neuroni ippocampali. I neuroni isolati formano una rete 2D sull'area attiva dell'array di microelettrodi e aderiscono alle microsfere di vetro in una piastra multipozzetto con un inserto a membrana. Dopo aver trasferito queste microsfere rivestite di neuroni all'elettrodo, si organizzano in una rete neurale 3D interconnessa.

Costruzione di reti neuronali tridimensionali accoppiate a array di microelettrodi

Il video dimostra come utilizzare un array di microelettrodi (MEA) per registrare l'attività elettrofisiologica dei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). L'attività elettrofisiologica di un MEA multipozzetto contenente una co-coltura neurone-astrocitario viene registrata per rilevare potenziali d'azione da più neuroni nella rete, confermando il successo della differenziazione delle hiPSC in neuroni.

Misurazione dell'attività elettrofisiologica delle reti neuronali utilizzando array di microelettrodi

Questo video dimostra la registrazione dell'attività neurale spontanea e dipendente dalla stimolazione da colture primarie di neuroni gangliari a spirale murina (SGN) su un array multielettrodo (MEA). Implica il lavaggio e la preparazione del MEA, la registrazione dell'attività neurale spontanea e l'applicazione di stimoli elettrici controllati per identificare l'attività neuronale dipendente dalla stimolazione.

Analisi dell'attività neurale nei neuroni gangliari a spirale murini primari utilizzando array multielettrodi

Questo video presenta registrazioni elettrofisiologiche da co-colture organotipiche di fette di midollo spinale, catturate utilizzando un array multi-elettrodo o un dispositivo MEA. Queste registrazioni valutano la rigenerazione neuronale tra le fette. L'attività elettrica sincronizzata osservata conferma il successo della rigenerazione neurale.

Registrazioni elettrofisiologiche per la valutazione delle rigenerazioni neuronali in fette di midollo spinale co-coltivate

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Utilizzo di array multielettrodo per misurare la fisiologia sinaptica in sfere di cocoltura 3D

Questo video dimostra la creazione di una co-coltura neurone-astrocita per la registrazione dell'attività della rete neuronale. Dopo aver stabilito la co-coltura di motoneuroni e astrociti su una piastra multi-electrode array (MEA), l'attività elettrica ritmica sincrona della rete neuronale è stata registrata extracellulare utilizzando il MEA.

Registrazione dell'attività elettrofisiologica della rete neuronale in una co-coltura neurone-astrocitaria

In questo lavoro, un nuovo modello sperimentale in cui le colture neuronali 3D sono accoppiate a array di microelettrodi planari (MEA) è presented. 3D le reti sono costruite seminando i neuroni in un'impalcatura composta da microsfere di vetro su cui i neuroni crescono e formano strutture 3D interconnesse.

Interfacciamento 3D Engineered neuronali Culture a Micro-Electrode Array: Un innovativo<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello sperimentale

Presentiamo un protocollo per la coltura di espianti di neuroni gangliari murini a spirale primaria su array multi-elettrodi per studiare i profili di risposta neuronale e ottimizzare i parametri di stimolazione. Tali studi mirano a migliorare l'interfaccia neurone-elettrodo degli impianti cocleari a vantaggio dell'udito nei pazienti e del consumo energetico del dispositivo.

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Questo protocollo mira a dimostrare come combinare in vitro microelettrodi con dispositivi microfluidici per lo studio della trasmissione del potenziale d'azione in colture neuronali. Analisi dei dati, vale a dire l'individuazione e la caratterizzazione dei materiali di moltiplicazione di potenziali di azione, è eseguita utilizzando un nuovo avanzato, ma facile da usare e liberamente disponibile, strumento computazionale.

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