Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Ciao, mi chiamo Ena e facciamo regolarmente la profilazione dell'espressione genica in laboratorio. E usiamo questa tecnica per monitorare i geni regolati differenzialmente tra metanfetamina e wild type. E oggi ho un tipo selvatico e campioni di RNA di metanfetamina e tutti facciamo prima il C.

Utilizziamo metodi di etichettatura indiretta e il vantaggio di questa tecnica è quello di prevenire i pregiudizi oculari che possono verificarsi nell'etichettatura diretta. E per fare questo abbiamo campioni di RNA e optiamo per ottenere tre microgrammi di RNA in 13 microlitri di volume totale. E aggiungiamo 2,5 micro di lui casuale nei nostri parchi.

E incuberemo il campione a sette cinque gradi per avere la natura dell'RNA per otto minuti. E ora aggiungeremo il, aggiungeremo il cocktail di trascrizione inversa che contiene AM L-D-L-D-U-T-P continu mix, tampone di trascrittasi inversa e anche ET TT Big it down E incubare il campione a 42 gradi per quattro ore. Quindi, dopo quattro ore, tiriamo fuori i campioni.

E ora nel tubo abbiamo un mix di CDNA e RNA. E quello che vogliamo fare è fare l'idrossiRNA aggiungendo idrossido di sodio e EDTA e la concentrazione finale per l'idrossido di sodio dovrebbe essere un centinaio molare. E la concentrazione finale per e BT dovrebbe essere cinque molari.

E ora incuberemo i campioni a bagnomaria a 65 gradi per 10 minuti. Quindi l'incubazione è terminata e utilizzeremo i campioni aggiungendo pH sette cumuli di acqua alla concentrazione finale di 500 molari. A questo punto è possibile conservare i campioni a meno 20 oppure si può continuare con la pulizia.

Per la pulizia del CDNA, utilizziamo il kit di purificazione KaiGen PCR. Tuttavia, dal momento che il tampone Bush e il buffer ionico contiene liberazione, non lo facciamo, prepariamo il nostro buffer cespuglio del destino e il buffer ionico del destino e aggiungerai 300 litri di PPI e condurremo lentamente quello stagno verso il basso per trasferire la miscela in colonne E girerai per un minuto alla massima velocità E guarderai il, il buffer che abbiamo preparato. Tampone di lavaggio fosfato, aggiungerai 750 microlitri e così via, e ne aggiungerai un altro per uno di nuovo.

Quindi gireremo di nuovo solo per assicurarci di avere tutto a letto. E trasferiremo questi tubi in tubi vuoti per i trasgressori. E aggiungerò 30 marcatori del tampone fosfato E, che è quattro molari di fosfato di potassio a pH 8,5.

E qui devi solo assicurarti di aggiungere tutto al centro della colonna e incuberai a temperatura ambiente per un minuto. Quindi girerà di nuovo per un minuto e aggiungerò un altro 30 micro zero buffer che incubo o camera da letto. Quindi rimuovo la colonna e abbiamo un volume totale di 60 micros o CDA.

Una volta ripulito il CDNA, è possibile, è possibile conservarlo a meno 20 gradi e possiamo anche asciugarlo e poi conservarlo in modo da poter asciugare il CDNA in feedback. Quindi ora nel tubo abbiamo il CDA secco, che è stato modificato. E quello che faremo è sospendere il campione secco.

Sospendo il campione in 10 ture di bicarbonato 15 LAR a pH nove. E lo farò semplicemente andando su e giù in questo passaggio, è molto importante per Resus il cDNA. Beh, per la reazione dell'azienda di acquisto al lavoro, questa reazione dovrebbe avvenire nella camera oscura perché le etichette fluorescenti sono sensibili allo stampo.

Tuttavia, la scelta di questi dalle scienze della vita e sono, sono arrivati in pacchetti individuali. S cinque ha il cappuccio viola e il lato tre ha il cappuccio arancione e anche S cinque appare Sion quando viene sospeso e Cary appare magenta. Quindi quello che farò in camera oscura è trasferire questi campioni in tubi di colorante, sospenderò nuovamente il colorante e li trasferirò di nuovo nel tubo che ho.

E poi incuberò al buio per due ore dopo due ore di incubazione queste reazioni di arresto aggiungendo 35 re di un centinaio di millimolari di acetato di sodio a pH 5,2. E dopo di che abbiamo ripulito con la procedura di pulizia simile. Tuttavia, questa volta utilizziamo il tampone di lavaggio e il tampone di eluizione forniti da Cajun.

È possibile descrivere i punti in cui si inserisce il campione e che dovrebbero pulire lo strumento. Quindi puoi il tuo campione o la tua miscela in questo momento I To, quindi questo è il mio campione etichettato scifi e qui quello che vediamo è OD due 60, che mostra il contenuto CDA e OD sei 50, che mostra l'incorporazione D per scifi. Ed ecco il mio esempio di etichetta sul lato tre.

Ancora una volta, torsione sei concentrazione e cinque 50 misure sito tre incorporazione. Dal momento che la mia società D funziona in modo efficiente, combinerò i campioni Ora, Ms.Miss it brevemente. E ora scriveremo di nuovo un esempio utilizzando il feedback.

Ok, quindi per l'izzazione dello scivolo, reidrateremo mettendo universalmente lo scivolo sopra l'acqua e questo renderà i punti più grandi. E poi, per proteggerlo, ci asciugheremo a un centinaio di gradi Celsius e poi ibridificheremo UV o collegheremo UV le macchie nel vetrino e poi incuberemo nel buffer pre alto che abbiamo. Quindi posiziono lo scivolo a faccia in giù, ma non tocca ancora l'acqua.

E aspetteremo così per cinque minuti. Io, quindi questa scatola sembra più grande, dovrebbero essere più lucidi di prima di metterli, e ti asciugherai semplicemente mettendo il vetrino su un centinaio di gradi e osserverai la condensa. E ci collegheremo con tei.

Quindi, per l'idratazione, immergerò lo scivolo nell'acqua prebellica. E questo dovrebbe essere molto veloce perché l'obiettivo qui è quello di sbarazzarsi di tutte le macchie o di tutti gli oligo sul posto che non sono collegati. E se vai piano in questo processo, otterrai solo code sui tuoi punti.

Quindi assicurati solo che lo stai facendo davvero velocemente e assicurati di non prendere il tuo volo fuori dall'acqua e fare questa roba per 30 secondi e fut immediatamente a temperatura ambiente per cinque minuti e 700 pm d'aria Prendi questo, inseriamo questo scivolo nel buffer della stazione di tubi prebellico che avevamo e spingendo lentamente il vetrino nel barattolo e lo incuberemo a 42 gradi per a almeno 45 minuti. Quindi ecco il nostro campione essiccato da ibridare. Quindi prima sospenderemo Resus in acqua.

In questa fase ci limitiamo a sospendere accadendo su e giù e possibile non esporre il campione troppo bianco, bianco. E poi si aggiunge il DNA dello sperma di qualcuno 1,5 e la concentrazione è di 10 milligrammi per mil. E aggiungerai 1.2 marketer di TRNA.

La concentrazione è di 12,5 milligrammi per, aggiungiamo tRNA e DNA spermatico per bloccare l'idro non specifica. E aggiungiamo 5,35 marcatore zero tre XSSC, che dà la concentrazione finale di tre x. E infine aggiungiamo 3,5 microlitri di SDS all'1%.

Ora faremo bollire il composto per cinque minuti e gireremo alla massima velocità per cinque minuti e sarà pronto per averlo quello. È passata un'ora da quando abbiamo incubato il nostro vetrino e in questo momento ho acqua e isopropanolo. Quindi agiterò prima il vetrino in acqua per eliminare la SDS e poi laverò il tuo propanolo dza e lo metterò direttamente nel calibro standard.

E qui, fai solo attenzione a non esporre troppo la luce all'aria per evitare che si secchi. Così vado direttamente dal buffer della stazione di danno in acqua e laviamo lo scivolo. Un paio di minuti, assicurati solo che il movimento sia solo su e giù, non lateralmente.

E assicurati anche che lo scivolo non sia sopra l'acqua e lo trasferiremo immediatamente in isopropanolo. E rimane qui per un paio di minuti di nuovo. E potrebbe la tua pagina Si prega di rispondere alla tua pagina a temperatura ambiente per cinque minuti?

700 R.Cool. Quindi anche il nostro scivolo è pronto per essere ibridato ed è meglio se lo tieni in una scatola per vetrini per proteggerlo dal bus. Quindi, per la stazione di raccolta, useremo l'ascensore o lo scorrimento.

Ci sono strisce bianche sul vetrino coprioggetto e forniranno un po' di portanza e forniranno un po' di spazio per il nostro campione da inserire tra il vetrino coprioggetti e il vetrino. E lo pulisco con l'etanolo E poi il filo messo giù E mi assicuro che non ci siano particelle di prova. Quindi, per prima cosa prenderemo il nostro modello di diapositiva che abbiamo contrassegnato nell'area di stampa e sopra di essa metteremo la diapositiva che abbiamo preparato e ci assicureremo che si allineino perfettamente.

Assicurati che siano perfettamente allineati. E devi assicurarti che le strisce siano sul lato, che lo affronteremo. Quindi è davvero difficile da vedere, ma assicurati di poterlo vedere.

E le strisce dovrebbero essere ai lati delle diapositive. E caricheremo il nostro campione dai lati. Prelevo piccole quantità di campione, quindi prendo prima 15 microlitri e inizio a caricare dall'angolo del vetrino coprioggetto.

E lentamente lo tiravo dentro e mi muovevo lungo il bordo per coprire tutta l'area. In questa fase è molto importante non introdurre bolle e prendo un altro 15 migrator e lo applico ai lati dei vetrini per evitare che si secchi. Quindi il nostro campione è pronto e incuberete i nostri vetrini e le camere di prioritizzazione, che hanno micro canali per idratare il vetrino durante l'ibridazione.

E aggiungeremo 10 marketer di tre XSSC in sei angoli della diapositiva. C'erano sei posti sul, sulla camera, scusate, su ogni angolo I, e su ogni lato, Assicurati di trasferire il vetrino molto delicatamente in modo che il vetrino coprioggetto non scivoli via. E quando metti lo scivolo con il lato destro rivolto verso l'alto, vedrai che si accumulerà, si attaccherà all'acqua che hai messo e metti il coperchio E assicurati che le viti siano serrate.

Incuberemo la camera di conversazione a una sacca d'acqua a 65 gradi, ma non vogliamo metterla direttamente sul fondo. Quindi abbiamo semplicemente messo una sorta di barriera di plastica per prevenire un eccessivo trasferimento di calore. E posizioniamo delicatamente la nostra camera di cottura e per evitare qualsiasi spostamento, puoi anche mettere una sorta di peso.

E questa incubazione durerà tutta la notte, in genere tra le 10 e le 12 ore. Quindi, per il lavaggio della fetta, usiamo un XSSC con lo 0,05% di SDS. Questo servirà per rimuovere il vetrino coprioggetto.

E questo sarà per lavare il primo passo. E faremo altri due passaggi solo con lo 0,06% di sei XSC attraverso tutte le SDS che abbiamo. Quindi tutti noi fottiamo la conversazione e prendiamo delle diapositive e le mettiamo a faccia in giù nel contenitore della borsa.

E lo scuoteremo da un lato all'altro e vedremo che il vetrino coprioggetto cadrà delicatamente. Va bene, e, E ci trasferiremo in un altro buffer di lavaggio che contiene XES. Mangi per un minuto.

Passa a andare oh sei XSSC. E solo per assicurarci di sbarazzarci di tutto l'FDS, lo ripeteremo ancora una volta. La centrifuga per asciugare è stata a temperatura ambiente per cinque minuti a 700 RP. Si tiene questa diapositiva nella casella di presentazione perché è sensibile alla luce.

Quindi questo è uno scanner per diapositive e metterai la diapositiva qui, poco spazio proprio qui, metterai la diapositiva a faccia in giù, etichettata verso e, E nella seconda diapositiva definirai solo l'area che vuoi scansionare. E prenderai semplicemente quest'area nelle nostre diapositive. Abbiamo, usiamo 16 spille per stampare le nostre diapositive.

Quindi ogni blocco corrisponde a un perno e le nostre diapositive contengono oltre 8.000 punti. E rappresentiamo il genoma del colore vi due volte perché si tratta di circa 4.000 geni. Quindi abbiamo due punti per ogni oligo che utilizziamo.

E se questi ingrandiscono, come si può vedere in questo particolare esperimento, confrontiamo i mutanti regolatori di trascrizione con quelli wild type, e il mutante verrebbe etichettato con scifi, che dà il colore rosso. E il tipo selvatico era il sito tre, che dà il colore verde. Quindi tutto ciò che sembra rosso, come queste macchie, indica che l'abbondanza dei trascritti nel mutante era superiore a quella del tipo selvatico.

Quindi appaiono rossi o sfumature di rosso, e tutto ciò che apparirebbe verde indica che l'abbondanza del trascritto era più alta nel tipo selvatico rispetto al mutante. E qualsiasi punto che appare giallo indica che quel trascritto era ugualmente presente sia nel mutante che nel tipo selvatico. Quindi, quando si sovrappongono, apparirebbero gialli come questi ma.