Name: IP-FCM: Immunoprecipitazione rilevato mediante citometria di flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Scopri il metodo IP-FCM per analizzare interazioni proteiche native in biologia cellulare e biochimica. Questa tecnica di immunoprecipitazione con citometria di flusso rileva complessi proteici con alta sensibilità anche con campioni limitati.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Premio Innovazione Eagles (Fraternal Order of Eagles) e dalla Fondazione Mayo.

** Questo protocollo video si basa su una pubblicazione associata 1: ad alta sensibilità di rilevazione e analisi quantitativa dei nativi interazioni proteina-proteina e complessi multiproteici mediante citometria a flusso. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang WA Schamel, Ed. Palmer. Scienza STKE 2007 (389): PL2, 5 giugno 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">Clicca qui per vedere questa pubblicazione</a> . Prima di partire, Preparare le seguenti soluzioni acquose archivi: <table><tbody><tr><td> MES Accoppiamento buffer: </td><td> Conservare a 25 ° C </td></tr><tr><td> MES, pH 6,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tempra / Blocco / Storage (QBS) Buffer: </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Di sodio azide </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> FCM buffer: </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> Di sodio azide </td><td> 0,02% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5% </td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> 1x </td></tr></tbody></table> Preparare immediatamente prima dell'uso: <table><tbody><tr><td> EDAC-MES: </td><td> Sciogliere 50 mg / ml polvere EDAC nel tampone MES accoppiamento </td></tr><tr><td> Digitonina soluzione (2% w / v): </td><td> Sciogliere in polvere digitonina dH 2 O da riscaldamento a 95 ° C per 5 minuti poi il raffreddamento su ghiaccio </td></tr><tr><td> Lysis buffer: </td><td></td></tr><tr><td> Tris, pH 7,4 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 Mm </td></tr><tr><td> Digitonina soluzione </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Inibitori della proteasi </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Tenere su ghiaccio </td><td></td></tr></tbody></table> 1. Accoppiamento di mAb di Perle <ol><li> Determinare la concentrazione di perline dallo stock acquistato da diluire in PBS e contando con un emocitometro. Inizia con una diluizione 1:10000 di perline per il conteggio. </li><li> Pipettare 18 x 10 6 perle in un 1,5 mL provetta. </li><li> Lavare le perline 2 o 3 volte in 0,5-1,0 mL di tampone di accoppiamento MES, centrifugazione a 20.000 g per 3 minuti a 25 ° C dopo ogni lavaggio. </li><li> Risospendere le sfere in 50 microlitri Buffer accoppiamento MES. </li><li> Attivare i gruppi carbossilici sulla perle aggiungendo 20 l di preparati al momento EDAC-MES. </li><li> Mescolare delicatamente per 15 minuti a 25 ° C manualmente pipettando su e giù. </li><li> Lavare le perline attivate 2 o 3 volte in 0,5 a 1,0 ml di PBS, centrifugazione a 20.000 g per 3 minuti a 25 ° C dopo ogni lavaggio. </li><li> Risospendere le sfere attivato in 50 microlitri di PBS. </li><li> Aggiungere 50 microlitri della IP mAb (a 0,2-1,0 mg / ml concentrazione stock) alla soluzione attivata tallone. </li><li> Mescolare per 3 o 4 ore a 25 ° C posizionando il tubo su una vibrante shaker. Agitare sufficiente per evitare sedimentazione delle perline sul fondo della provetta. </li><li> Lavare mAb-perline accoppiate 2 o 3 volte in 0,5 a 1,0 ml di PBS, centrifugazione a 20.000 g per 3 minuti a 25 ° C dopo ogni lavaggio. </li><li> Risospendere le sfere in 100 microlitri Buffer QBS. Questi possono essere conservato a 4 ° C. </li><li> Sospendere le perline bene, diluire 1:200-1:10,000 in PBS e contare con un emocitometro. La concentrazione deve essere misurato per ciascun lotto preparativa, in modo che il numero di perline usato in ogni esperimento IP o pull-down può essere controllato con precisione. </li></ol> 2. Post-nucleare Preparazione del lisato e Ip Il metodo di lisi e le condizioni di lisi ottimale dipenderà dal tipo di cellula e le interazioni proteina-proteina in esame. Un certo numero di protocolli esistenti e può essere modificato per l'applicazione. <ol><li> Lyse 20 x 10 6 'piccolo' cellule, come i linfociti, o 5 x 10 6 'grandi' le cellule, come i macrofagi o cellule tumorali, in 100 microlitri di buffer di lisi fresco in un 1,5 mL provetta per 20 minuti sul ghiaccio. Scala il volume lisi, se necessario. </li><li> Per rimuovere i nuclei e insolubili detriti cellulari, centrifugare il lisato a 20.000 g per 10 minuti a 4 ° C. Tenere il supernatante e scartare il pellet. </li><li> Aggiungere 0,5 x 10 5 a 2,5 x 10 5 mAb-perline accoppiate al lisato chiarificato, pipettare delicatamente per mescolare. Il volume minimo che usiamo pereseguire un singolo IP è di 5 microlitri. </li><li> Mettere su una ruota in movimento verticale 4 ore per notte in una stanza fredda. Impostare a velocità sufficiente per evitare che le perle di assestamento. È accettabile che il liquido di basso volume IP di rimanere nel fondo della provetta durante la rotazione. </li></ol> 3. Probing di Bead-capture di proteine ​​con Fluorocromo anticorpi coniugati <ol><li> Lavare le perline IP due volte in 0,2 a 1,0 ml ghiacciata buffer FCM, centrifugazione a 20.000 g a 4 ° C per 3 minuti dopo ogni lavaggio. </li><li> Risospendere le sfere in 100 ul FCM tampone e aliquota 20 l in ciascuno dei cinque o più di 1,5 mL microprovette o pozzi di un camino con fondo piatto. </li><li> Aggiungi coniugato a un fluorocromo anticorpi monoclonali ai campioni. Eseguire la FCM macchia secondo le istruzioni del fornitore o in base a concentrazioni empiricamente determinato. Come punto di partenza, aggiungere 0,2 a 1 microlitri di soluzione madre di anticorpi (a 0,2-1,0 mg / ml) al tubo o bene e incubare per 40 minuti sul ghiaccio. </li><li> Lavare sondato perline in tubi da 1,5 ml due volte in 1,0 ml ghiacciata buffer FCM, centrifugazione a 20.000 g a 4 ° C per 3 minuti dopo ogni lavaggio. Rimuovere delicatamente il supernatante dopo ogni lavaggio, facendo attenzione a non disturbare le perline. Per un camino a fondo piatto, lavare due volte con 0,2 mL ghiacciata buffer FCM, centrifugazione a 1000g per 5 minuti a 4 ° C dopo ogni lavaggio. Una pipetta multicanale è utile per questo passo. Per rimuovere il surnatante da perle in un camino-piastra inferiore, 'sfogliare' il piatto una volta, poi, mentre ancora a testa in giù, ogni macchia gocciola dai bordi dei pozzi. Il volume residuo in ciascun pozzetto, contenente le perline, sarà di circa 20 l. </li><li> Risospendere le sfere in 200 Buffer FCM microlitri per campione. Trasferimento a tubi etichettati FACS. I campioni sono ora pronti per FCM. </li></ol> 4. FCM Acquisizione Le perle CML descritte in questo protocollo sono da 3 a 5 micron di diametro, circa la metà del diametro di un linfocita del mouse quiescente. Pertanto, può essere necessario aumentare manualmente il Forward Scatter (FSC) guadagno amplificatore e il Side Scatter (SSC) di tensione in modo che la popolazione di eventi tallone di registrare su scala. Individuale perline IP dovrebbero formare un unico popolo strettamente cluster. Le impostazioni e cancello deve essere regolato per escludere doppietti tallone e detriti. <ol><li> Prima di perline in esecuzione standard o tallone, rimuovere il manicotto di contenimento goccia che circonda l'ingresso del campionatore su alcuni citometri. Che il liquido guaina a gocciolare tra i campioni, in modo da cancellare l'ingresso ed impedire perline di essere riportati da un campione all'altro. </li><li> Usa perle senza etichetta, un controllo negativo di fluorescenza, e particelle di calibrazione arcobaleno (RCPs), un controllo positivo di fluorescenza, per regolare le impostazioni in modo che entrambi gli estremi negativi e positivi fluorescenza appare contemporaneamente sul log-scala asse delle ascisse. Questo assicura che la fluorescenza da campioni sperimentali saranno inoltre on-scala. Si noti che RCPs sono più piccole rispetto alle perle CML, in modo da FSC e parametri SSC, nonché la posizione cancello, potrebbe essere necessario essere temporaneamente modificato per quel campione. </li><li> Torna a senza etichetta-tallone impostazioni una volta di calibrazione con RCPs è completa. Se solo una sonda fluorescente per campione è usato, senza compensazione della fluorescenza è necessario. In generale, si sonda complessi multiproteici con un solo fluorocromo-coniugati mAb per campione FCM, e prendiamo in esame l'interazione partner più dalla colorazione parallelo campioni di cordone con anticorpi monoclonali specifici per le subunità diverse. </li><li> Acquisire e salvare i file di dati di fluorescenza. L'analisi può essere effettuata utilizzando il software citometria a flusso come CellQuest, FlowJo, o CFlow. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. IP-FCM per TCR/CD3 complesso multiproteico. Cellule T dal ceppo di topi BALB / c sono state lisate in 1% digitonina, e il lisato è stato sottoposto a IP-FCM con anti-CD3ε perline. I complessi catturato conteneva quantità significative di TCR-β (regione viola) e co-associati CD3-ε (verde), ma vicino ai livelli di fondo (definito dalla sonda immunoglobuline irrilevante, rosa traccia) di altre proteine, come Thy1.2, CD45, o H-2K (d) (marrone, arancio, blu e tracce, rispettivamente). Vedi simili risultati precedentemente pubblicati 1-6.

<ol><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8%2B+memory+versus+effector+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li>
<li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and%2For+calcium+store+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li>
<li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li>
</ol>

Informazioni sulle interazioni proteina-proteina è molto importante per l&#39;analisi di molti processi cellulari come la trasduzione del segnale, la maturazione lignaggio, progressione del ciclo cellulare, apoptosi e cascate. IP-FCM fornisce un modo rapido, quantitativa e sensibile di esaminare l&#39;interazione delle proteine ​​e definiscono i membri di complessi multiproteici nella loro conformazione nativa. Sfere possono essere accoppiati e incubato con lisati cellulari in un giorno e possono essere esaminati e analizzati il ​​giorno successivo. A 96 pozzetti formato piastra permette un gran numero di campioni da analizzare in una sola volta per fornire efficienti di raccolta dati a fini statistici o di screening. Utilizzando perline fluorescenti standard, il numero di proteine ​​catturate da ogni perla può essere stimata. Molto materiale di origine poco è necessario per la cattura e il rilevamento, in modo da campioni limitati e scarsa analiti possono ancora essere analizzati per le interazioni multiple. Sebbene IP-FCM non richiede manipolazione genetica, epitopo-tagging, denaturazione, in vitro o miscelazione di proteine ​​in modo non fisiologico ambiente, può essere accoppiato con queste e altre tecniche, che lo rende uno strumento valido e accessibile con applicabilità a molti sistemi biologici. Risoluzione dei problemi: Molti IP-FCM esperimenti di generare dati utili interazioni proteiche la prima volta che sono tentato. Tuttavia, l&#39;ottimizzazione di IP-FCM può migliorare la coniugazione di anticorpi a perline, catturare le proteine ​​complesse, e la sonda fluorescente vincolanti. L&#39;efficienza di coniugazione degli anticorpi IP può essere determinato dal sondaggio perline accoppiate direttamente con un anticorpo anti-immunoglobulina. Se questo rendimento è basso, aumentando la concentrazione di anticorpi durante la reazione di accoppiamento può permettere anticorpi più IP ad allegare ad ogni tallone. Questo può aumentare la capacità di legame del lotto IP tallone, con conseguente acquisizione maggiore e la rilevazione di analiti. Altre molecole contenenti ammine primarie (ad esempio tris, albumina di siero bovino) non deve essere presente durante la reazione di accoppiamento, in quanto questi possono competere con i mAb per il fissaggio tallone e risultato a basso accoppiamento mAb. Se coniugazione di mAb di perline si rivela problematica per altre ragioni, perline può invece essere accoppiato ad avidina / streptavidina, e gli anticorpi biotinilati può successivamente essere non un legame covalente e utilizzati per immunprecipitation. Nonostante la coniugazione degli anticorpi buona, la rilevazione iniziale di perline associate fluorescenza può essere bassa. In primo luogo, la cattura complesso si può essere bassa. Poiché IP-FCM dipende dalla concentrazione di analiti, aumentando il numero di cellule lisate per unità di volume lisi può aumentare la cattura degli analiti e la rilevazione. Inoltre, l&#39;acquisizione può essere migliorata riducendo il numero di perline IP incubati con il lisato, che distribuisce i complessi catturati attraverso un minor numero di perle, e si traduce in un aumento medio per fluorescenza tallone quando sondato. In secondo luogo, è possibile che l&#39;accesso degli anticorpi sonda ai complessi catturato è stericamente ostacolato dalla anticorpi immunoprecipitating. In questo caso, il problema può essere affrontato utilizzando anticorpi diversi per catturare e / o sonda.

<table><tbody><tr><td>perle di lattice di polistirene modificate con carbossilato (CML) (5 mm senza surfattante)</td><td>Reagente</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>2-5000</td><td>Conservare a 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Particelle di calibrazione Rainbow</td><td>Reagente</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>RCP-30-5A</td><td>Conservare a 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Acido 2-[N-morfolino]etansolfonico (MES)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5287</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato di 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimmina (EDAC)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22980 E-6383</td><td>Conservare a -20&amp;#x00B0;C in condizioni disidratanti.</td></tr><tr><td>Cocktail generico di inibitori delle proteasi, contenente AEBSF, Bestatina, Aprotinina, EDTA, E-64 e Leupeptina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2714</td><td>Preparare una soluzione madre 100x in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Aliquotare e conservare a -20&amp;#x00B0;C. Manipolare con guanti.</td></tr><tr><td>Piastre PCR, 96 pozzetti, 0,2 mL, colore naturale, con pareti alte</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-230</td><td>Da utilizzare al posto delle provette microcentrifuga durante la colorazione FCM</td></tr></tbody></table>

ip-fcm: immunoprecipitazione rilevato mediante citometria di flusso

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitazione rilevata mediante citometria di flusso (IP-FCM) è un metodo efficace per il rilevamento e la quantificazione interazioni proteina-proteina. Il principio di base che si estende su panino ELISA, in cui l&#39;analita catturato primario può essere rilevato insieme con altre molecole associate fisicamente all&#39;interno di complessi multiproteici. La procedura prevede accoppiamento covalente di microsfere in lattice di polistirene con immunoprecipitating anticorpi monoclonali (mAb) specifico per una proteina di interesse, incubando queste perle con lisati di cellule, sondando complessi di proteine ​​catturate con fluorocromo-coniugati sonde, e analizzando perline associati fluorescenza mediante citometria di flusso. IP-FCM è estremamente sensibile, permette l&#39;analisi delle proteine ​​nella loro nativa (non denaturato) dello stato, ed è suscettibile di entrambe le analisi semi-quantitativa o quantitativa. Come ulteriori vantaggi, IP-FCM non richiede manipolazione genetica o attrezzature speciali, che non sia un citofluorimetro, e può essere facilmente adattato per applicazioni ad elevato throughput.

L&#39;IP-FCM metodo viene presentato, che permette una sensibile, robusto, la valutazione biochimica di natale interazioni proteina-proteina, senza la necessità di ingegneria genetica o di campioni di grandi dimensioni.

IP-FCM: Immunoprecipitazione rilevato mediante citometria di flusso

L'immunoprecipitazione rilevata tramite citometria a flusso (IP-FCM) è un metodo efficiente per rilevare e quantificare le interazioni proteina-proteina. Il principio...

Negli esperimenti di FCM con immunoprecipitazione, i complessi proteici vengono catturati su microsfere al fine di identificare e studiare le diverse proteine che interagiscono tra loro. In primo luogo, un anticorpo immunoprecipitante specifico per la proteina di interesse viene legato covalentemente a microsfere di lattice di polistirene. Nella seconda fase, queste microsfere vengono incubate con lisati cellulari, consentendo alla proteina specifica e alle proteine interagenti di legarsi alle microsfere.I microsfera insieme alle proteine catturate vengono quindi lavati e sottoposti a sonda con anticorpi marcati fluorescentemente specifici per diverse molecole che potrebbero essere associate alla proteina immunoprecipitata. Infine, i microsfera marcati fluorescentemente vengono analizzati mediante citometria a flusso per determinare quali proteine sono presenti e quali sono assenti dai complessi catturati. I vantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come l'immunoprecipitazione seguita da western blotting, consistono nella capacità dell'I-P-F-C-M di consentire la valutazione di interazioni proteina-proteina native senza richiedere ingegneria genetica o grandi quantità di campione.I-P-F-C-M può produrre un elevato rapporto segnale-rumore anche quando è disponibile una quantità molto ridotta di biomateriale per l'analisi, poiché può essere eseguito con piccoli volumi e basse concentrazioni di analiti. Per iniziare questa procedura, preparare i seguenti tamponi: tampone di accoppiamento MES, tampone di bloccaggio per l'arresto della reazione, abbreviato QBS, e tampone per citometria a flusso o FCM. Determinare la concentrazione delle perle di lattice di polistirene modificate con gruppi carbossilici o perle CML diluendole in PBS e contandole con un emocitometro.Dopo aver determinato la concentrazione delle perle, pipettare 18 volte 10 alla sesta perle in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Lavare le perle da due a tre volte in 0,5-1 millilitro di tampone di accoppiamento MES, centrifugando a 20.000 × g per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo ogni lavaggio, mentre le perle sono in centrifugazione.Preparare fresco tampone MES da utilizzare per l'attivazione delle perle. Una volta completati i lavaggi, mantenere il tampone a temperatura ambiente o in ghiaccio. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le perle in 50 microlitri di tampone di accoppiamento MES.Quindi aggiungere 20 microlitri di MES EEC alla sospensione di perle. Per attivare i gruppi carbossilici sulle perle, mescolare delicatamente a temperatura ambiente pipettando manualmente su e giù in modo continuo per 15 minuti. Sebbene questo passaggio richieda molto lavoro manuale, questo metodo di mescolamento fornisce i migliori risultati dopo la miscelazione.Lavare le perle attivate due o tre volte in 0,5-1 millilitro di PBS Centrifusion a 20.000 × g per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo ogni lavaggio e dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le perle attivate in 50 microlitri di PBS per accoppiare l'anticorpo IP alle perle. Aggiungere 50 microlitri dell'anticorpo monoclonale IP da una soluzione madre con concentrazione compresa tra 0,2 e 1 milligrammo per millilitro.Assicurarsi che non siano presenti molecole contenenti ammine primarie diverse dall'anticorpo. Queste molecole contenenti ammine, come il tris o l'albumina sierica bovina, competono con l'anticorpo per il legame ai microsferini. Mescolare la sospensione di anticorpi legati ai microsferini su un agitatore vibrante per tre o quattro ore a temperatura ambiente.Agitare sufficientemente per evitare il deposito delle perle sul fondo del tubo. Dopo il legame, lavare le perle coniugate con l'anticorpo da due a tre volte in 0,5-1 millilitro di PBS, centrifugando a 20.000 × g.Centrifugare per tre minuti a temperatura ambiente dopo ogni lavaggio. Infine, risospendere le perle in 100 microlitri di tampone QBS. Il legame degli anticorpi monoclonali alle perle CML può essere verificato colorando le perle con anticorpi coniugati a fluorocromi diretti contro IgG.Dopo l'analisi mediante FCM, le microsfere rivestite con l'anticorpo monoclonale possono essere conservate a quattro gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo in un esperimento di IP. Per prima cosa, sospendere bene le microsfere e diluirle da uno a 200 a uno a 10.000 in PBS, quindi contare con un emocitometro. La concentrazione deve essere misurata per ogni lotto preparativo in modo da poter controllare con precisione il numero di microsfere utilizzate in ciascun esperimento di IP.Successivamente, preparare una soluzione fresca di dig in acqua al 2% peso/volume. Riscaldare a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente raffreddare in ghiaccio.Diluire, aggiungere al 1% in peso per volume in tampone di lisi appena preparato e mantenere sul ghiaccio. Determinare il numero di cellule da lisare utilizzando la tabella mostrata come guida. Tuttavia, il numero di cellule necessarie dipende dalla proteina di interesse e deve essere determinato empiricamente.Qui vengono utilizzate 30 volte 10 alla sesta cellule provenienti da una linea cellulare di tumore linfocitico piccolo. Trasferire il volume richiesto di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Pellettare le cellule a 20.000 volte.Centrifugare per 30 secondi a quattro gradi Celsius ed aspirare il mezzo. Aggiungere la quantità appropriata di tampone di lisi Dig appena preparato al pellet, mescolando delicatamente mediante pipettaggio su e giù.Quindi lasciare le cellule lisare per 20 minuti sul ghiaccio. Si noti che, a seconda del tipo cellulare e delle interazioni proteina-proteina studiate, le condizioni di lisi cellulare possono variare e devono essere determinate empiricamente quando la lisi è completa. Rimuovere i nuclei e i detriti cellulari insolubili centrifugando il lisato a 20.000 ×g.Centrifugare per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Conservare il soprannatante e scartare il pellet per permettere al proteina bersaglio di legarsi alle perline rivestite con anticorpo. Aggiungere da 50.000 a 250.000 perline coniugate con anticorpo monoclonale al lisato chiarificato, pipettando delicatamente.Per eseguire un'immunoprecipitazione singola, il volume minimo di lisato da utilizzare è di cinque microlitri. Posizionare il lisato chiarificato insieme al mix di perle su una ruota verticale rotante per un periodo compreso tra quattro ore e tutta la notte, in una cella frigorifera, a una velocità sufficiente a impedire che le perle si depositino sul fondo del tubo; in questo modo, il liquido può rimanere nella parte inferiore del tubo durante la rotazione. Questo passaggio segue il legame della proteina bersaglio con l'anticorpo per l'immunoprecipitazione.Procedere all'etichettatura fluorescente del complesso immunitario. Lavare le perle di immunoprecipitazione due volte in un millilitro di buffer FCM freddo, centrifugando a 20.000 ×g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Dopo ogni lavaggio, risospendere le perle in 100 microlitri di buffer FCM e aliquotare 20 microlitri in ciascuna di cinque provette o più.Tubi microcentrifugetati da 1,5 millilitri o pozzetti di una piastra con fondo a camino. Entrambi sono mostrati qui. Aggiungere agli campioni gli anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromo.Eseguire la colorazione mediante FCM seguendo le istruzioni del fornitore o utilizzando concentrazioni determinate empiricamente come punto di partenza. Aggiungere da 0,2 a un microlitro di soluzione anticorpale madre con concentrazione di almeno 0,1 milligrammi per millilitro per tubo o pozzetto e incubare per 40 minuti sul ghiaccio. Lavare le microsfere marcate in tubi da 1,5 millilitri due volte con un millilitro di liquido freddo di ghiaccio.Tampone FCM, centrifugando a 20.000 × g a quattro gradi Celsius per tre minuti. Dopo ogni lavaggio, rimuovere delicatamente il soprannatante dopo ogni lavaggio, avendo cura di non disturbare le perle.In alternativa, per un impianto a camino, lavare due volte la piastra inferiore con 0,2 millilitri di tampone FCM freddo di ghiaccio, centrifugando a 1000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo ogni lavaggio, dopo ogni lavaggio. Per rimuovere il sopranatante dalle perle, agitare leggermente la piastra una volta, quindi, mantenendola ancora capovolta, assorbire eventuali gocce dai bordi dei pozzetti.Il volume residuo in ogni pozzetto contenente le perle sarà di circa 20 microlitri. Sospendere le perle in 200 microlitri di tampone FCM per ogni campione e trasferirli in provette fax etichettate. I campioni sono ora pronti per la citometria a flusso o FCM su citometri Becton Dickinson e analoghi.Rimuovere la guaina di contenimento della goccia che potrebbe circondare l'ingresso del campione o il beccuccio. Lasciare che il beccuccio goccioli tra un campione e l'altro, poiché ciò impedirà il trasferimento di perline da un campione all'altro. Le perline CML utilizzate in questo caso hanno un diametro compreso tra tre e cinque micrometri, circa la metà del diametro di un linfocita murino quiescente.Pertanto, potrebbe essere necessario aumentare manualmente il guadagno dell'amplificatore dello scatter anteriore e la tensione dello scatter laterale in modo che la popolazione di eventi relativi ai microsferini venga registrata sul citometro. A tal fine, si utilizzano microsferini non marcati o vuoti. Le impostazioni nel software GAIT vengono regolate per escludere i microsferini, i doppietti e gli abri prima della lettura.I campioni sperimentali garantiscono che la fluorescenza sarà entro scala. Le microsfere non marcate fungono da controllo negativo per la fluorescenza, mentre le particelle di calibrazione rainbow o RCPs possono essere utilizzate come controllo positivo per la fluorescenza. Poiché le RCPs sono più piccole delle microsfere CML, i parametri di scattering anteriore e scattering laterale, così come la posizione nel gating, potrebbero dover essere modificati temporaneamente per questo campione.Dopo queste calibrazioni, gli estremi negativi e positivi della fluorescenza vengono visualizzati su un asse logaritmico. Al termine della calibrazione con i RCP, ripristinare le impostazioni dei microsfera non marcati per l'avanti e lo scatter laterale. Finché viene utilizzata una sola sonda fluorescente per campione, come nell'esperimento mostrato qui, non è necessaria alcuna compensazione della fluorescenza.Ora acquisire e salvare i file dei dati di fluorescenza; l'analisi viene successivamente eseguita utilizzando software di citometria a flusso come Cell Quest o FlowJo. Di seguito è riportato il risultato di un'analisi IP FCM di linfociti T murini LY in digitonina al 1%. Il complesso non proteico TCR CD3 è stato immunoprecipitato con perle anti-CD3 epsilon.I complessi catturati contengono quantità significative di TCR beta e di CD3 epsilon associato. Sono state rilevate livelli prossimi al fondo di altre proteine, come determinato mediante l'uso di una sonda di immunoglobulina irrilevante o di anticorpi contro le proteine TH 1.2, CD 45 o H two KD. I vantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come l'immunoprecipitazione seguita da western blotting, risiedono nella capacità dell'I-P-F-C-M di consentire la valutazione di interazioni proteina-proteina native senza la necessità di ingegneria genetica o di grandi quantità di campione. L'I-P-F-C-M può produrre rapporti segnale-rumore elevati anche quando è disponibile una quantità molto limitata di biomateriale per l'analisi, poiché può essere eseguito con volumi ridotti e basse concentrazioni di analiti.

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