Name: Volume fisso o fisso di pressione: un modello murino di shock emorragico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 31 s
Description: Impara un modello murino di shock emorragico a volume o pressione fissi per studiare le risposte immunologiche e la funzione d'organo post-trauma. Questo metodo consente il monitoraggio fisiologico continuo.

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Fonte di finanziamento / Numero Biologia molecolare dello shock emorragico GM053789

1. Strumento e preparazione del campo chirurgico: 1. Strumento di preparazione. Tutte le procedure chirurgiche sono eseguite utilizzando tecniche asettiche. Un blocco chirurgico blu e spogliatoio campo sterile vengono utilizzati. Tutti i materiali e gli strumenti sono sterilizzati prima dell&#39;uso. 6-0 sutura, applicatori punta del cotone, garza, maschio-maschio 3-way rubinetti, e gli strumenti sono sterilizzati in autoclave. Trasduttori, PE-50, e tubi in PE-10 sono l&#39;ossido di etilene sterilizzati. Tutti i rubinetti a 3 vie, siringhe e aghi sterili vengono ricevuti. 6-0 sutura viene tagliato in pezzi da 1 pollice (6 pezzi / animale) e mettere in sacchetti di sterilizzazione di piccole dimensioni. Cotone punta applicatori, piazze garza 4x4, maschio-maschio e 3-way rubinetti sono messi in due sacchetti di piccole o medie dimensioni e la sterilizzazione in autoclave. I nostri strumenti chirurgici vengono sterilizzati in autoclave ogni sera. Vengono lavate dopo l&#39;intervento chirurgico con sapone antibatterico e acqua del rubinetto. Essi sono autorizzati ad asciugare su una superficie pulita tampone chirurgico blu. Sono poi accuratamente inseriti in un sacchetto di sterilizzazione e sterilizzato per il giorno successivo. Dal momento che i trasduttori e il tubo hanno componenti in plastica, devono essere sterilizzati con gas, ossido di etilene ad esempio. PE-10 tubo viene tagliato in pezzi da 5 pollici e inserito in un sacchetto di sterilizzazione di piccole dimensioni. PE-50 tubo viene tagliato in pezzi da 18 pollici e inserito in un sacchetto di sterilizzazione media. 2. Campo chirurgico. Per configurare il campo chirurgico, in primo luogo, accendere lo sterilizzatore a caldo tallone per assicurarsi che raggiunge la temperatura appropriata-300-350 ° F prima di interventi chirurgici. Poi procedere con i passi successivi mettendo chirurgica pastiglie blu giù su un alcool spazzato da banco. Un pad va sotto il microscopio e l&#39;altro prosegue il termoforo circolazione dove si trovano gli analizzatori di BP. Posizionare un campo sterile medicazione sopra entrambe le pastiglie blu chirurgico. Riempire un vassoio degli strumenti in acciaio inox 1 / 3 del modo con il 70% di alcol. Usare abbastanza 70% EtOH per coprire tutti gli strumenti chirurgici. Utilizzare una medicazione separato campo sterile e posizionarlo accanto al microscopio. Mettere tutti gli strumenti sterili, sutura, garze, cateteri e su questo campo sterile. Fare attenzione quando si aprono strumenti sterili e suturare Per non contaminarli toccandoli. E &#39;meglio usare guanti sterili quando si fa questa procedura di configurazione. 2. Set-up meccanico e procedure: 1. Catetere Set-up. Per configurare il catetere gamba destra murino utilizzato per misurare la pressione arteriosa, in primo luogo, mettere i guanti sterili. Quindi ottenere la sterile PE-10 tubi dal sacchetto in autoclave. Prendete la metà del tubo con dito indice e il pollice lasciando circa un centimetro tra di loro. Tratto questa sezione del tubo solo un po &#39;per renderlo più sottile di diametro per aiutare con l&#39;inserimento del catetere. Dopo lo stretching il tubo tagliato a metà con le forbici sterili. Il 5-pollici tubo dovrebbe ora essere due pezzi di circa 2 ½ pollici di lunghezza. Assicurati di smusso alla fine allungati. * NON angolo il bordo smussato troppo in quanto ciò potrebbe aumentare le possibilità di uscire dal lume colpendo con la parte inferiore della parete del vaso. Inserire un ago 30G nella distenderla fine smussata del tubo. Prendi una siringa sterile 1cc e un rubinetto a 3 vie. Utilizzare un batuffolo imbevuto d&#39;alcol per sterilizzare la parte superiore del flaconcino 10cc sterile contenente la soluzione salina eparinata (0,1 ml Heparin/9.9ml Saline). Riempire la siringa con 0.6-0.7cc della soluzione di eparina. Applicare l&#39;ago 30G e catetere fino alla fine del 3-way che si trova direttamente di fronte al terminale maschio. Riempire il rubinetto, ago 30G, e tubi in PE-10 con la soluzione di eparina. Assicurarsi di avere tutte le bolle d&#39;aria dal sistema. Il modo più efficace per rimuovere tutte le bolle d&#39;aria è quello di utilizzare la gravità. Punto l&#39;ago verso il suolo, mentre lasciando penzolare tubi al banco. Dare il mozzo dell&#39;ago un semplice movimento delle dita e le bolle che galleggiano alla parte superiore della soluzione di eparina. Rimuovere l&#39;ago 30G da 3-way e rimuovere le bolle. Ritirare fluido nel 3-way nella siringa 1cc per rimuovere eventuali bolle che sono intrappolati nel 3-way e riattaccare il tubo alla strada-3. Circa 1cc della miscela deve rimanere nella siringa. Il mouse riceverà circa 0.05cc di questa miscela (a causa del lavaggio del catetere per mantenere la pervietà dopo l&#39;inserimento), pari a circa 1U eparina / mouse. Posto questo catetere completato sul campo sterile vestirsi con gli strumenti chirurgici. Per configurare il catetere gamba sinistra murino seguire la stessa procedura come sopra descritto, con l&#39;eccezione del rubinetto a 3 vie. La gamba sinistra viene utilizzata per disegnare il sangue e il 3-way rubinetto non è necessaria. Riempire un&#39;altra siringa sterile 1cc con 0,15-0.2cc della miscela eparinizzato salina. Collegare l&#39;ago 30G e PE-10 tubing direttamente alla siringa 1cc. Compila questo sistema catetere gamba sinistra con la soluzione. Rimuovere le bolle da questo sistema, anche. Posizionare il catetere completato sul campo sterile vestirsi con gli strumenti sterili. 2. Trasduttore di Set-up. Collegare un trasduttore sterile al digi-med BPA 400 analizzatore secondo le micro-med specifiche. Collegare un rubinetto a 3 vie ad entrambe le estremità del trasduttore. Riempire una siringa da 10 cc con soluzione Ringer lattato (LR) e allegarlo al 3-way in modo che il trasduttore si sdraiarsi sul bancone. Inserire un ago 23G in entrambe le estremità del pezzo di pretagliate presterilizzati 18-pollici tubi PE-50. Collegare un&#39;estremità del tubo PE-50 per il 3-way con la siringa 10cc allegato. Riempire il 3-way e PE-50 set-up con LR. Assicurarsi di avere tutte le bolle d&#39;aria fuori dal sistema, come descritto nella sezione precedente. Ricollegare il 3-way al trasduttore e riempire il trasduttore e 2 ° a 3 vie con LR. Infine, collegare il maschio-maschio in metallo leur-lock rubinetto per l&#39;ago 23G del PE-50 tubi per il collegamento al catetere gamba destra murini. * E &#39;fondamentale che il liquido rimanere nel trasduttore durante il funzionamento. * Seguire la calibrazione e zero le procedure in base alle micro-med protocollo. 3. Procedure chirurgiche e sperimentali: 1. Procedure chirurgiche. Iniziare con la somministrazione di un&#39;iniezione intraperitoneale di sodio Pentobarbitol (Nembutol) (70mg/kg @ diluizione 1:10). Questa procedura è compiuta, in primo luogo, raccogliendo il mouse verso l&#39;alto dalla sua gabbia con la base (alla fine la maggior parte prossimale) della sua coda. Quindi, posto che l&#39;animale in cima alla gabbia, mentre ancora in mano la coda. Afferra la collottola collo del mouse con il pollice e il medio su entrambi i lati del mouse appena dietro le zampe anteriori. Il dito indice è utilizzato per tirare la pelle sulla testa / collo regione indietro verso la collottola per immobilizzare la testa. La coda del topo viene poi avvolto e tenuto tra il mignolo e l&#39;anulare, mentre l&#39;anulare è premuto nella regione lombare della colonna vertebrale del mouse. Il mouse deve essere addormentato entro 5 minuti. Dopo che l&#39;animale è anestetizzato loro posto sulla piastra di metallo chirurgico in posizione supina. Piede libero tecnica nastro ciclo viene usato per immobilizzare gli animali da nastro adesivo loro estremità. La tecnica comporta ciclo perdere semplicemente tagliando sottili strisce di nastro e avvolgere il nastro liberamente attorno a ciascuna delle arti anteriori inferiori alla zampa e attorno a ciascuna delle arti posteriori inferiori alla zampa. Il nastro viene poi bloccato a se stessa e la sinistra su nastro è attaccato alla tavola. Questo consente alle estremità dei topi di assumere una posizione anatomica più naturale. Aree addominale e inguinale dell&#39;animale sono poi rasata con Oster formato A5 tagliatori 40 lama. Una garza 4x4 è cosparso con Betadine e l&#39;area chirurgica viene poi cancellato per la sterilità. Dopo l&#39;immobilizzazione e la sterilizzazione, un cono con 1cc di isofluorano è posta sopra il naso del mouse per alcuni secondi prima di effettuare l&#39;incisione iniziale. Il cono è costituito da un tubo 50cc conica riempita con una garza. La metà della parte inferiore del tubo è tagliato fuori creare uno spazio per il naso del mouse per riposare dentro senza contatto. Un berretto (fondo di un contenitore di stoccaggio dei tessuti) è collocato sull&#39;estremità del cono 50cc a garantire i vapori isoflurano non sfuggono. Una volta respirazione degli animali cominciano a rallentare, un piccolo di 4-5mm incisione è realizzata in pelle parallelo a sinistra muscolo obliquo interno dell&#39;addome sinistro e il muscolo addominale trasversale. La dissezione della vena e dell&#39;arteria femorale segue. Assicurarsi di non danneggiare i muscoli che circondano i nervi o toccare. Per iniziare questa dissezione, separare il tessuto adiposo dai muscoli addominali obliqui e trasversali afferrando il tessuto adiposo con l&#39;Dumonts alla connessione addominale. Tirare questo tessuto dalla parete muscolare. Poi, smussato lungo sezionare i muscoli addominali prendere in giro fuori fascia e del tessuto adiposo mediante l&#39;altra coppia di Dumonts. Proprio sotto questo tessuto adiposo si trovano la vena femorale e l&#39;arteria con il nervo femorale. * Assicurarsi di non danneggiare l&#39;vasto intermedio, mediale e laterale del muscolo quadricipite femorale o il retto femorale. Non c&#39;è davvero bisogno di afferrare o anche toccare questi muscoli. * Non toccare il nervo femorale Sezionare il nervo via afferrando il tessuto adiposo che si trova accanto ad esso. Tirare questo tessuto lateralmente dalla vena e arteria e il nervo seguirà in quanto è integrato in questo tessuto. Poiché il nervo è tirato lateralmente, smussato sezionare la fascia mettendo il Dumonts, il punto verso il basso, contro l&#39;arteria e la loro apertura e chiusura. I vasi sono molto superficiali in modo da essere sicuri di nonscavare nei muscoli sottostanti. Dopo che il nervo è separato, utilizzare il Dumonts per separare la fascia tenendo i vasi per i muscoli. Tenere il Dumonts chiuso e scivola il dorsale Dumonts ai vasi. Come la punta del Dumonts appare sul lato opposto della vena, aprirli per smussare sezionare la fascia. Mantenere la dorsale Dumonts alla nave e prendete la prima sutura. Mettere la sutura nel Dumonts e tirare la sutura posteriore attraverso l&#39;apertura tra i vasi ed i muscoli sottostanti. Anche in questo caso, non c&#39;è bisogno di alcun danno muscolare circostante. Mettere un totale di 3, 6-0 punti di sutura intorno alla vena e arteria. Sutura 1 è il più prossimale ai muscoli addominali. Un nodo, ma lasciarlo libero e hemostat fuori. Il bordo concavo del hemostat deve poggiare sulla cavità addominale dell&#39;animale. Sutura 2 è il più distale in posizione. Questa sutura può essere legato immediatamente legatura dei vasi e hemostated, sempre lato concavo verso il basso. Le suture distali e prossimali sono usati per estrarre i vasi teso (per prevenire la perdita di sangue) e sollevarli un po &#39;di aiuto in inserzione del catetere. Sutura 3 è una sutura supporto catetere. Inserire questo sutura tra le suture distali e prossimali. Un nodo allentato che verrà utilizzato per fissare il catetere all&#39;interno della nave dopo l&#39;inserimento. Dopo le suture sono sicure, identificare l&#39;arteria dalla parete del vaso di spessore. E &#39;molto bianca. Fai una piccola incisione sulla parte superiore dell&#39;arteria con il microscissors. Rendono questo foro vicino alla sutura distale per cui vi è una grande quantità di arteria per l&#39;inserimento del catetere iniziale. Utilizzare il Dumonts per aprire il buco inserendo un&#39;estremità del Dumonts nel lume del vaso arterioso e la chiusura oltre le pareti dei vasi. Assicurarsi che la sutura medio è in prossimità del buco arteriosa in modo che possa essere usato per tenere il catetere in posizione dopo l&#39;inserimento iniziale. Mantenendo la parete arteriosa spingere il catetere nel lume del vaso mentre si tira su il catetere. Leggermente vincolare la sutura mezzo di supporto per tenere il catetere in posizione. Rilasciare il hemostat prossimale. Questa versione avrà un allentamento della sutura prossimale e riaprire la sutura intorno ai vasi. A questo punto, la pressione arteriosa dovrebbe spingere il sangue indietro nel catetere. Il sangue pulsa dovrebbe essere visibile nel catetere. Tenere i vasi intorno al catetere con una Dumont e utilizzare l&#39;altro per spingere il catetere nel vaso circa 4-5mm. Tenendo la nave intorno al catetere aiuta a prevenire la lacerazione dell&#39;arteria. La punta del catetere dovrebbe trovarsi appena sotto i muscoli interni addominale obliquo e trasversale. Per la prevenzione coagulo di sangue nella linea arteriosa, prelevare il sangue nel catetere e spingerlo nuovamente dentro il mouse più volte per infondere liquidi eparinizzato. Ripetere la procedura per l&#39;altra gamba per incannulazione bilaterale dell&#39;arteria femorale. Agganciare l&#39;animale fino al monitoraggio dei parametri fisiologici, cioè il BPA-400 analizzatore e lavare le linee arteriosa. Mettere 1 o 2 gocce di soluzione salina sterile nell&#39;apertura chirurgica per mantenere umido il tessuto circostante. Essere sicuri di mantenere questa area satura tutta la procedura. Posizionare un campo sterile medicazione sopra l&#39;animale durante tutta la procedura per aiutare a mantenere la sterilità. Luogo strumenti chirurgici in 70% di alcol e pulire con garza sterile. Metterli nel tallone per la sterilizzazione a caldo circa 20 secondi per la sterilizzazione tra gli animali. Rimuovere gli strumenti chirurgici e spruzzare con alcool al 70% per aiutarli a rinfrescarsi. Metterli sul tampone sterile. Assicurarsi che non vi è alcuna alcol lasciato sugli strumenti che goccia di nuovo nel prossimo animali. 2. Shock emorragico. Più di un 15min. periodo di tempo, circa 1 / 2 del volume di sangue del mouse viene ritirata assicurare una pressione arteriosa media di 28-32mm Hg. * Per un 25-27g del mouse il volume iniziale di sangue prelevato per ottenere la pressione desiderata è di circa 0.6cc Questa procedura è un metodo di pressione fisse, in alternativa ad un volume fisso. Queste procedure possono tuttavia essere seguito sia per la pressione fissi ed emorragia volume fisso. Pur essendo costantemente monitorati, l&#39;animale rimane in stato di shock emorragico per 1,5-tre ore. Come l&#39;animale cerca di compensare e la pressione arteriosa media comincia a salire di nuovo leggermente (visibile attraverso il BP / AR analizzatore) prelevare più del sangue per ottenere la pressione desiderata. Anche se gli integratori (0.05cc IP Nembutol) sono raramente necessarie durante la procedura di HS, la respirazione animale, il movimento dei baffi, test riflessi, e la BP / AR digitale lettura aiuterà a determinare quando un animale ha bisogno di un supplemento di anestesia. Gli animali vengono tenuti sotto lampada e su una piastra elettrica circolante per aiutare a mantenere una temperatura di 36-37 ° C attraverso la procedura di shock emorragico. La temperatura è controllato tramite una sonda rettale. 3. Rianimazione. Dopo il tempo d&#39;urto Elapses, l&#39;animale è resuscitato (R) con Ringer lattato (LR) la soluzione ad un volume fisso di 3 volte il volume sparso il sangue di ogni animale. Il volume LR viene somministrato tramite una pompa siringa impostata per erogare, a velocità costante, il volume su un 15min. intervallo. Rimuovere il catetere e legare i vasi con i 3 punti di sutura. Tirare il catetere appena oltre la sutura prossimale e cravatta questa sutura completamente spento. Che impediscono qualsiasi perdita di sangue. Flusso collaterale impedisce agli arti posteriori di diventare ischemici. 4. Messaggio Rescitation. Dopo R entrambe le aperture degli arti posteriori sono cuciti usando sterile sutura 4-0 PDSII. Il nastro allentato ciclo viene rimosso e gli animali siano posti in una gabbia pulita, che è tenuta su una piastra elettrica in circolazione per diverse ore dopo il recupero. Analgesico deve essere somministrato come gli animali cominciano a svegliarsi dall&#39;anestesia a gestire correttamente il dolore. Buprenorfina (0.1mg/kg) viene iniettato per via sottocutanea come gli animali iniziano l&#39;attività fisica, ma non prima, in modo da non compromettere la funzione respiratoria. Utilizzo del monitoraggio post-operatorio aggressivo quanto garantito dal protocollo IACUC approvato, i comportamenti singolo animale, e le attuali condizioni mediche è raccomandato. 4. Segreti per il successo: <ol><li> Quando la dissezione dei vasi, assicuratevi di non toccare il nervo femorale </li><li> Essere sicuri di non danneggiare il retto femorale, retto laterale e muscoli vasto mediale. Non c&#39;è davvero bisogno di afferrare o anche toccare questi muscoli. </li><li> Non fare l&#39;angolo dello smusso del catetere troppo forte come questo porterà al catetere esce dal lume e sanguinamento incontrollato </li><li> Assicurati di prendere la massima attenzione per rimanere sterile possibile. </li><li> Assicurarsi che non vi siano bolle d&#39;aria in uno qualsiasi dei sistemi di catetere o trasduttore. </li><li> Assicurarsi di avere fluido LR trasduttore mentre è in funzione. Un funzionamento a secco potrebbe danneggiare il sistema BP. </li><li> Effettuare il foro arterioso piccolo. </li><li> Effettuare il foro arterioso vicino alla sutura distale. </li><li> Spingere catetere e contemporaneamente tirando nave su di esso per inserire un catetere in modo da evitare lo strappo l&#39;arteria. </li><li> Assicurarsi di mantenere le aperture chirurgico alle gambe saturi con soluzione salina sterile per evitare danni incontrollata dei tessuti o perdita di liquidi. </li><li> La pazienza e finezza sono critici. </li><li> Prestate molta attenzione alla fisiologia dell&#39;animale tutto l&#39;esperimento. </li></ol> 5. Messaggio Preoccupazioni operativo: <ol><li> Verificare la presenza di ischemia in gamba. Anche se il flusso collaterale dovrebbe impedire questo. </li><li> Animale possa essere problemi con l&#39;uso degli arti posteriori a causa della manipolazione chirurgica e l&#39;infiammazione associati. Gestire il dolore in modo appropriato. </li><li> Toccando e, successivamente, danneggiando il nervo potrebbe portare all&#39;incapacità degli animali di mobilitare. </li></ol>

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Gli esperimenti sugli animali sono stati curati ed eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa e il comportamento di ricerca e Compliance Office dell&#39;Università di Pittsburgh, un AALAS pienamente accreditati / istituzione AALAC. Origine animale comprendono Jackson Laboratori e Charles Rivers Laboratories. Tutti gli animali sottoposti a garanzia estesa salute attraverso ogni fornitore così come l&#39;Università di Pittsburgh programmi interni di polizia sanitaria di monitoraggio. Questa ricerca è condotta in conformità con i principi del governo degli Stati Uniti per l&#39;utilizzo di animali vertebrati. Il programma viene registrato presso l&#39;USDA, e ha una lettera di garanzia con l&#39;Ufficio Public Health Service del benessere degli animali da laboratorio.

<table border="1"><tbody><tr><th> Strumento </th><th> Fabbricante </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Dumonts (SS/45 ° angolo 0.2x0.12mm punta, lunghezza 13,5 centimetri) </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11203-25 </td></tr><tr><td> Forbici chirurgiche (straight-12cm) </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 14068-12 </td></tr><tr><td> Hemostats (curva-12,5 cm) </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 13009-12 </td></tr><tr><td> Microscissors (primavera forbici-straight-8 cm) </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> Pinza (0,8 mm-punta, curva-10cm) </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11050-10 </td></tr><tr><td> sutura bobina 6-0 </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 18020-60 </td></tr><tr><td> sutura PDSII 4-0 </td><td> Penn Vet </td><td> ETHZ304H </td></tr><tr><td> garza 4x4 </td><td> possono essere acquistati attraverso qualsiasi fornitore globale </td><td></td></tr><tr><td> cotone punta dell&#39;applicatore </td><td> possono essere acquistati attraverso qualsiasi fornitore globale </td><td></td></tr><tr><td> 30G ago </td><td> possono essere acquistati attraverso qualsiasi fornitore globale </td><td></td></tr><tr><td> 23G ago </td><td> possono essere acquistati attraverso qualsiasi fornitore globale </td><td></td></tr><tr><td> 3 cc siringa </td><td> possono essere acquistati attraverso qualsiasi fornitore globale </td><td></td></tr><tr><td> 5 cc siringa </td><td> possono essere acquistati attraverso qualsiasi fornitore globale </td><td></td></tr><tr><td> 10cc siringa </td><td> possono essere acquistati attraverso qualsiasi fornitore globale </td><td></td></tr><tr><td> 50cc tubo conico </td><td> possono essere acquistati attraverso qualsiasi fornitore globale </td><td></td></tr><tr><td> 1cc siringa w / ago 25G </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826-88 </td></tr><tr><td> 10 tubi in polietilene 100 `(PE-10) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-170-12P </td></tr><tr><td> 50 tubi in polietilene 100 `(PE-50) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-170-12B </td></tr><tr><td> 3-way rubinetto </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9779127 </td></tr><tr><td> chirurgico pad blu </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50-7105 </td></tr><tr><td> Medicazione sterile sul campo </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9517505 </td></tr><tr><td> rotoli di nastro da 1 &quot; </td><td> Corporate Express </td><td> MMM26001 </td></tr><tr><td> rettilineo lato vasetti bocca larga (usato come tappo per cono) </td><td> VWR </td><td> 159000-058 </td></tr><tr><td> vaschetta in acciaio inox da 8 &quot;x 11&quot; </td><td> VWR </td><td> 62687-049 </td></tr><tr><td> maschio-maschio leur lock 3-way </td><td> VWR </td><td> 20068-909 </td></tr><tr><td> sterilizzazione sacchetto 3 &quot;x8&quot; </td><td> VWR </td><td> 24008 </td></tr><tr><td> sterilizzazione sacchetto 5 &quot;x10&quot; </td><td> VWR </td><td> 24010 </td></tr><tr><td> Selvatico M650 microscopio w / braccio stare </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Leica IC D fotocamera digitale / immagini live </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Numero di Digi-Med BPA-400 analizzatore e integratore di sistemi </td><td> Micro-Med </td><td> SYS-400 </td></tr><tr><td> TXD-310 (Digi-Med trasduttore) </td><td> Micro-Med </td><td> TXD-300 </td></tr><tr><td> Computer </td><td> Conca </td><td></td></tr><tr><td> Hot tallone strumento sterilizzatore </td><td> VWR </td><td> 18000-45 </td></tr><tr><td> Oster A5 Clippers w. lama taglia 40 </td><td> VWR </td><td> 10749-020 </td></tr><tr><td> circolanti riscaldamentg pad 18x26 </td><td> Harvard </td><td> py872-5272 </td></tr><tr><td> termometro rettale </td><td> Kent scientifico </td><td> RET-3 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Concentrazione </th><th> Fabbricante </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Di sodio pentobarbital (soluzione di sodio Nembutol) </td><td> 70mg/kg </td><td> Ovazione </td><td></td></tr><tr><td> La buprenorfina cloridrato </td><td> 0.1mg/kg </td><td> Laboratori di Bedford </td><td></td></tr><tr><td> Ringer lattato iniezione 250cc IV borsa </td><td> Baxter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aerrane (isoflurano) </td><td> 99,9% </td><td> NLS Animal Health </td><td> 105996 </td></tr><tr><td> Eparina sodica </td><td> 1000U </td><td> Abraxis </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio batteriostatico </td><td> 0,9% </td><td> Hospira </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;alcol etilico </td><td> 70% </td><td> Farmaco-AAPER </td><td></td></tr><tr><td> Triadine Povidone iodio (Betadine) </td><td></td><td> Triade monouso </td><td></td></tr></tbody></table>

volume fisso o fisso di pressione: un modello murino di shock emorragico

Fixed Volume or Fixed Pressure: A Murine Model of Hemorrhagic Shock

E &#39;risaputo che la perdita di sangue gravi e lesioni traumatiche può portare ad una cascata di eventi dannosi di segnalazione spesso danno luogo a mortalità. 1, 2, 3, 4, 5 Questi eventi di segnalazione può anche portare a sepsi e / o disfunzione d&#39;organo multipla (MOD ). 6, 7, 8, 9 E &#39;fondamentale poi per indagare sulle cause di soppressione della funzione immunitaria e dannoso cascate di segnalazione al fine di sviluppare modi più efficaci per aiutare i pazienti che soffrono di lesioni traumatiche. 10 Questo fisso shock emorragico pressione (HS) procedura, anche se tecnicamente impegnativo, è una risorsa eccellente per lo studio di queste condizioni fisiopatologiche. 11, 12, 13 I progressi nella valutazione dei sistemi biologici, cioè Systems Biology hanno permesso alla comunità scientifica per comprendere ulteriormente complesse reti fisiologico e modelli di comunicazione cellulare. 14 shock emorragico ha dimostrato di essere uno strumento fondamentale per svelare i modelli di comunicazione cellulare come si riferiscono alla funzione immunitaria. 15, 16, 17, 18 Questa procedura può essere masterizzato! Questa procedura può essere utilizzata come un volume fisso o approccio pressione fissa. Abbiamo adattato questa tecnica nel modello murino per potenziare la ricerca nel innata e adattativa funzione immunitaria. 19, 20, SA Grazie alla loro piccola dimensione nei topi 21 rappresenta una sfida unica. Tuttavia a causa di numerosi ceppi del mouse a disposizione, questa specie rappresenta una risorsa ineguagliabile per lo studio delle risposte biologiche. Il modello HS è un modello importante per lo studio di modelli di comunicazione cellulare e le risposte di sistemi come i sistemi ormonali e mediatori infiammatori, e segnali di pericolo, cioè umido e upregulation PAMP quanto suscita reazioni diverse che si differenziano dalle altre forme di shock. 22, 23 , 24, 25 Lo sviluppo di ceppi murini transgenici e l&#39;induzione di agenti biologici specifici per inibire la segnalazione hanno presentato preziose opportunità di chiarire ulteriormente la nostra comprensione del su e giù per regolazione della trasduzione del segnale dopo la grave perdita di sangue, cioè SA e traumi 26, 27 , 28, 29, 30. Ci sono numerosi metodi di rianimazione (R) in associazione con HS e traumi. 31, 32, 33, 34 Un metodo fisso rianimazione volume di soluzione ringer lattato esclusivamente (LR), pari a tre volte il volume del sangue versato, è utilizzato in questo modello per lo studio dei meccanismi endogeni come una lesione di organi a distanza e l&#39;infiammazione sistemica. metodo di 35, 36, 38 di rianimazione Questo è dimostrato di essere efficace nella valutazione degli effetti del trauma HS e 38, 39.

Il modello di shock emorragico è una risorsa affidabile e riproducibile agevolare l&#39;individuazione e la comprensione delle cascate di segnalazione associata ad infiammazione e danno d&#39;organo dopo un trauma. Questo articolo fornisce un passo-passo la descrizione degli aspetti chirurgici e meccanici associati alla procedura shock emorragico sperimentale nei topi.

Volume fisso o fisso di pressione: un modello murino di shock emorragico

È noto che una grave perdita di sangue e le lesioni traumatiche possono innescare una cascata di eventi di segnalazione dannosi che spesso portano alla mortalità. 1, ...

Per caratterizzare le risposte immunologiche allo shock ipovolemico, si esegue una procedura chirurgica durante la quale vengono dissecati e cateterizzati i vasi di un topo. Monitorando la fisiologia dell'animale mediante registrazione digitale e osservazione diretta, viene indotto uno shock emorragico per simulare un evento traumatico successivo allo shock indotto. Il topo viene rianimato, il catetere viene rimosso e all'animale viene consentito di riprendersi.Il topo può quindi essere studiato per valutare i cambiamenti nella funzione degli organi, nei modelli di comunicazione cellulare e nell'espressione genica attraverso una serie di tecniche come la citometria a flusso, l'ematologia, i blot immunoistochimici, l'immunohistochimica o il microarray genetico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che questo modello di shock emorragico a volume o pressione costante permette al ricercatore di controllare il grado di shock monitorando continuamente e registrando con precisione le fluttuazioni fisiologiche. Questo specifico metodo di shock emorragico migliora la capacità del ricercatore di studiare e comprendere la funzione immunologica in preparazione all'intervento chirurgico.Assicurarsi che siano disponibili le seguenti attrezzature e forniture sterili. Suture zero numero sei, applicatori in cotone e garza, valvole a tre vie maschio, trasduttori, pezzi da 18 pollici di tubo PE 50 e pezzi da cinque pollici di tubo PE 10. Gli strumenti chirurgici necessari sono valvole a tre vie, una siringa da 1 cc, una siringa da 10 cc, un ago da 23 gauge, un ago da 30,5 gauge, forbici microchirurgiche, pinzette fini, un kit chirurgico, pinzette, emostatici e forbici chirurgiche.Le forniture aggiuntive includono soluzione di Ringer lattato e soluzione alcolica per la preparazione cutanea. Sono necessari anche una tavola metallica, un campo sterile, guanti sterili, Betadine, soluzione salina sterile, soluzione salina eparinizzata e anestetico. Nel giorno dell'intervento chirurgico, preparare il catetere per l'arto inferiore destro utilizzato per misurare la pressione sanguigna indossando guanti sterili.Prendere con entrambe le mani la parte centrale di un pezzo di tubo PE 10 sterile lungo cinque pollici e allungarlo di circa un pollice per facilitare l'inserimento del catetere. Utilizzando le forbici sterili, tagliare il tubo a metà, arrotondando l'estremità allungata. Inserire quindi un ago da 30 gauge nell'estremità non allungata del tubo PE 10.Utilizzando un batuffolo imbevuto di alcol, sterilizzare la sommità di un flaconcino sterile da 10 cc contenente la soluzione salina eparinizzata. Riempire una siringa da 1 cc con 0,6-0,7 centimetri cubi di soluzione eparinica. Applicare un ago da 30 gauge e un catetere all'estremità di un rubinetto a tre vie, posizionandoli direttamente opposti rispetto all'estremità maschio.Riempire l'ago del rubinetto a 30 gauge e il tubo PE con la soluzione di eparina, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria. Rimuovere le bolle d'aria picchiettando leggermente, quindi staccare l'ago da 30 gauge dal rubinetto a tre vie ed aspirare il liquido presente nel rubinetto a tre vie nella siringa da un CC per eliminare eventuali bolle intrappolate nel rubinetto a tre vie, quindi riattaccare l'ago con il tubo collegato. Nella siringa dovrebbe rimanere circa 0,1 centimetri cubici della miscela.Per configurare il catetere di derivazione per la gamba sinistra, seguire la procedura appena descritta, omettendo il rubinetto a tre vie. Innanzitutto, pulire il sacco di soluzione di Ringer lattato con alcol. Successivamente, collegare un trasduttore sterile a un apparecchio per la misurazione della pressione sanguigna e della frequenza cardiaca secondo le specifiche micro me.Successivamente, collegare un rubinetto a tre vie a entrambe le estremità del trasduttore e appoggiarlo in piano sulla superficie del bancone. Riempire una siringa da 10 cc con soluzione di Ringer lattato e collegarla al rubinetto a tre vie. Inserire un ago da 23 gauge in entrambe le estremità di un tratto di 18 pollici di tubo sterile PE 50.Collegare un'estremità del tubo in PE al rubinetto a tre vie a cui è collegata la siringa da 10 cc. Quindi riempire il rubinetto a tre vie e l'allestimento in PE 50 con soluzione di Ringer lattato. Assicurarsi di eliminare tutte le bolle d'aria, come in precedenza.Successivamente, ricollegare il tre vie al trasduttore e riempirlo. Aggiungere un secondo tre vie con ringer lattato. Infine, collegare il rubinetto a bloccaggio metallico maschio-maschio all'ago da 23 gauge del tubo PE 50 per il collegamento al catetere speculare nella zampa destra.Gli strumenti sono ora pronti per essere utilizzati nelle procedure chirurgiche e sperimentali per dissezionare e cateterizzare i vasi del topo in preparazione all'induzione di shock. Iniziare posizionando un topo anestetizzato con pentobarbital sodico sulla piastra chirurgica in metallo. In posizione supina, immobilizzare l'animale mediante la tecnica del nastro a cappio allentato, che prevede l'avvolgimento di strisce sottili di nastro intorno a ciascun arto subito al di sotto del ginocchio e il loro fissaggio alla tavola utilizzando un rasoio elettrico per animali con lama di dimensione 40, rasare le aree addominale e inguinale dell'animale.Quindi, utilizzando una garza, pulire la zona con Betadine e alcol per sterilizzarla. Posizionare un cono nasale contenente un centimetro cubo di fluoruro sull'ore della del mouse. Una volta che la frequenza respiratoria dell'animale inizia a rallentare, verificare la profondità dell'anestesia mediante il riflesso di ritrazione dell'estensione degli arti.Posizionare una medicazione sterile sull'animale per tutta la durata della procedura per aiutare a mantenere la sterilit&agrave;. Quindi praticare un'incisione piccola, lunga quattro-cinque millimetri, parallela al muscolo obliquo interno sinistro dell'addome e al muscolo trasverso dell'addome sinistro. Avere cura di non danneggiare i muscoli circostanti o toccare i nervi.Utilizzare la pinza di Dumont per afferrare il tessuto nel punto di connessione addominale e separare il tessuto adiposo dai muscoli obliqui e trasverso dell'addome. Con l'altra coppia di forbici di Allison, praticare una dissezione ottusa lungo i muscoli addominali, staccando la fascia e il tessuto adiposo. Appena al di sotto di questo tessuto adiposo, come per la vena e l'arteria femorale, insieme al nervo femorale senza toccarlo, dissezionare il nervo femorale afferrando il tessuto adiposo adiacente.Estrarre questo tessuto lateralmente dalla vena e dall'arteria. Il nervo, che è incorporato in questo tessuto, seguirà il movimento poiché viene tirato lateralmente. Posizionare l'altra punta di Dumont contro l'arteria e aprirla e chiuderla.Procedere alla dissezione della fascia con strumento ottuso. I vasi sono molto superficiali, quindi fare attenzione a non penetrare nei muscoli sottostanti. Dopo aver isolato il nervo, mantenere il forceps di Dumont chiuso e farlo scivolare dorsalmente rispetto ai vasi.Quando la punta del forceps di Dumont appare sull'altro lato della vena, aprirla per dissezionare in modo ottuso la fascia. Mantenere il forceps di Dumont in posizione dorsale rispetto al vaso e afferrare la prima sutura. Quindi tirare la sutura all'indietro attraverso l'apertura creata tra i vasi e i muscoli sottostanti.Posizionare un totale di 3 6 0 punti di sutura intorno alla sutura venosa e arteriosa. Uno di questi è il più prossimale rispetto al nodo legato al muscolo addominale, ma lasciarlo lento e fissarlo con un emostatico. Il bordo concavo dell'emostatico deve appoggiare sulla cavità addominale dell'animale.Il punto di sutura due è il più distale nella posizione. Legare immediatamente questo punto di sutura per legare i vasi e fissarlo con un emostatico con il lato concavo verso il basso; i punti di sutura distale e prossimale vengono utilizzati per tirare i vasi in tensione al fine di prevenire la perdita di sangue e sollevarli leggermente per facilitare l'inserimento del catetere. Il punto di sutura tre deve essere posizionato tra i punti di sutura distale e prossimale.Per il supporto del catetere, fare un nodo lento che verrà utilizzato per fissare il catetere all'interno del vaso dopo l'inserimento. Una volta che i punti di sutura sono stati fissati, identificare l'arteria grazie alla parete vascolare spessa e al colore biancastro. Utilizzando le forbici microchirurgiche, praticare un piccolo taglio sulla parte superiore dell'arteria vicino al punto di sutura distale, in modo da avere una quantità sufficiente di arteria per l'inserimento iniziale del catetere.Posizionare un'estremità del forceps di Dumont all'interno della cavità del vaso arterioso e chiuderlo sul bordo del vaso per aprire l'orifizio, tenendo contemporaneamente ferma la parete arteriosa. Inserire il catetere nella cavità spingendolo in avanti, mentre si tira il vaso sopra il catetere. Fissare leggermente il punto centrale del filo di sostegno per mantenere il catetere in posizione.Quindi rilasciare l'emostato prossimale per allentare il punto prossimale e riaprire la sutura intorno ai vasi. A questo punto, la pressione arteriosa dovrebbe spingere il sangue nuovamente all'interno del catetere. Si dovrebbe osservare sangue pulsante all'interno del catetere.Tenere i vasi intorno al catetere con una mano e utilizzare l'altra per spingere il catetere all'interno del vaso. Quattro-cinque millimetri. La punta del catetere deve posizionarsi appena al di sotto dei muscoli obliquo interno e trasverso dell'addome.Collegare l'animale a un analizzatore BPA 400 e sciacquare le linee arteriose. Aggiungere una o due gocce di soluzione salina sterile nell'apertura chirurgica per mantenere umido il tessuto circostante durante le procedure di shock emorragico e rianimazione volte a indurre lo shock emorragico. Iniziare posizionando il topo anestetizzato sotto una lampada e su un tappetino riscaldante a circolazione d'acqua per aiutare a mantenere la temperatura tra 36 e 37 gradi Celsius.Successivamente, utilizzare una siringa per prelevare circa met&agrave; del volume ematico del topo nell'arco di 15 minuti, al fine di ottenere una pressione arteriosa media compresa tra 28 e 32 millimetri di mercurio. Dopo 1,5-3 ore, rianimare l'animale utilizzando una pompa per siringa per somministrare soluzione di Ringer lattato in un volume pari a tre volte quello emesso, a un flusso costante nell'arco di 15 minuti. Una volta completata la rianimazione, rimuovere il catetere e legare i vasi.Utilizzando tre punti di sutura, tirare il catetere appena oltre il punto prossimale, quindi annodare completamente questo punto per prevenire la perdita di sangue. Il flusso collaterale impedisce agli arti inferiori di diventare ischemici. Infine, suturare entrambe le aperture degli arti inferiori con un PDSI sterile quattro zero.Effettuo la sutura. Rimuovere il nastro adesivo e posizionare l'animale in una gabbia pulita, posta su un tappetino riscaldante per diverse ore. Post-operatorio.Questo diagramma rappresenta una panoramica della procedura di shock emorragico. Dopo la cannullazione bilaterale e il collegamento iniziale al monitor della pressione sanguigna, si registra un valore basale della pressione arteriosa della durata di cinque minuti. Una volta registrata una pressione sanguigna affidabile, si procede all'induzione dello shock, durante la quale il sangue viene prelevato dal catetere femorale per raggiungere una pressione arteriosa di 28 più o meno due millimetri di mercurio; il prelievo del sangue deve avvenire nell'arco di 15 minuti.Dopo l'induzione dello shock, si verifica un periodo di shock della durata di due ore e mezza, durante il quale viene effettuato un monitoraggio costante della pressione sanguigna nei piedi. Al termine del periodo di shock, viene effettuata una rianimazione controllata mediante una pompa a siringa che reinfonde nell'animale un volume di sangue pari a tre volte il volume di sangue prelevato. Infine, l'animale viene ricollegato ai monitor della pressione sanguigna per ottenere una nuova valutazione della baseline.Questo fenomeno dura circa da cinque a 10 minuti. Questa figura indica le risposte pro-infiammatorie e anti-infiammatorie associate allo shock emorragico. Si verifica una tempesta di citochine, in cui citochine pro-infiammatorie e anti-infiammatorie, insieme a macrofagi, cellule T e una miriade di altre risposte fisiologiche, interagiscono in un circuito di retroazione nel tentativo di riportare l'organismo a condizioni di omeostasi, riparando gli organi privi di ossigeno.Questa rappresentazione grafica indica la funzione epatica in topi wildtype sottoposti a due diversi tempi di shock emorragico rispetto a topi sham; il livello di alanina aminotransferasi o LT è mostrato nel grafico A e il livello di aspartato aminotransferasi o ST è mostrato nel grafico B. Gli enzimi epatici sono stati misurati mediante un analizzatore di chimica del sangue su plasma sanguigno. Queste immagini di microscopia a fluorescenza mostrano il tessuto polmonare in topi wildtype sottoposti a shock emorragico e topi di controllo.La colorazione dell'actina è mostrata in verde e grigio. La colorazione del nucleo è mostrata in blu. L'espressione di iNOS è mostrata in rosso, come si può vedere qui.I topi in stato di shock emorragico presentano un'infiltrazione distinta di iNOS, mostrata in rosso, nell'epitelio bronchiale e nell'endotelio vascolare del tessuto polmonare. Questa colorazione è assente nei topi di controllo sottoposti a procedura fittizia. Queste microfotografie mostrano sezioni di tessuto epatico provenienti da topi sottoposti a shock emorragico o da topi di controllo, fissati in paraformaldeide e colorati con ematina o eosina.La sezione di tessuto prelevata da topi sottoposti a shock emorragico ha mostrato tessuto necrotico a causa della circolazione e ossigenazione compromesse, che non è stato osservato nei topi sottoposti a procedura fittizia. Quando si tenta questa tecnica, è molto importante ricordare di essere estremamente pazienti e precisi nella tecnica chirurgica e nell'indurre l'emorragia. Si tenga presente che questo modello può essere combinato con altri modelli traumatici, come frattura bilaterale del femore, pseudo-frattura e trauma dei tessuti molli, al fine di rispondere a domande relative all'immunologia dei traumi multipli.

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