Identificare i geni disregolazione indotta da sarcoma di Kaposi associato Herpesvirus (KSHV)
14 settembre 2010
Fattori cellula ospite giocano un ruolo critico nella creazione e mantenimento di sarcoma di Kaposi (KS). Delineiamo metodi per identificare i fattori cellula ospite alterato nelle cellule DMVEC KSHV-infetti, e nel tessuto tumorale KS. Geni cellulari alterato da virus servirà come potenziale bersaglio (s) per nuove terapie.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'etichettatura doppia del tessuto tumorale del sarcoma di Kaposi mediante immunohistochemia per proteine virali e cellulari dell'ospite. Questo viene ottenuto innanzitutto esponendo gli antigeni mediante calore. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'applicazione dell'anticorpo primario coniugato alla biotina.
Il terzo passaggio della procedura consiste nell'aggiunta del coniugato enzimatico strep din. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'aggiunta del substrato enzimatico al tessuto per lo sviluppo del colore. Alla fine, è possibile ottenere risultati che mostrano la localizzazione sia delle proteine virali che delle proteine delle cellule ospiti nel tessuto tumorale mediante colorazione immunoistochimica.
Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della patologia, come l'identificazione di agenti infettivi e di geni cellulari disregolati nello stesso campione. Sotto cappa, posizionare fino a otto vetrini ChemEight con sezioni di cinque micrometri di tessuto fissato in paraffina in un barattolo Coplin contenente xilolo. Incubare per 10 minuti per deparaffinizzare e preparare i vetrini per l'immunohistochimica a doppia marcatura.
Ridratare il tessuto in una serie di soluzioni di etanolo al 100%, 95% e 70%, per cinque minuti ciascuna. Trasferire i vetrini in acqua per almeno 10 minuti prima della rivelazione dell'antigene, nota anche come recupero dell'antigene per la rimozione della mascheratura. Immergere i vetrini in un contenitore di plastica contenente una soluzione appena preparata a 95 gradi Celsius.
Riscaldare in un forno a microonde una soluzione tampone al citrato 50 millimolare per mantenere l'ebollizione a 95 gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire immediatamente i vetrini in un contenitore pieno di acqua distillata a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini in un barattolo coplanare pulito riempito con una soluzione di bloccaggio appena preparata.
Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per inibire la perossidasi endogena. Lavare tre volte con 1X PBS a temperatura ambiente per cinque minuti per ogni lavaggio. Rimuovere i vetrini dal lavaggio con PBS e scuotere via l'eccesso, quindi coprire il tessuto con 200 microlitri di soluzione bloccante fredda su ghiaccio e sovrapporre una striscia di paraffina per prevenire l'essiccazione.
Posizionare i vetrini in una camera umidificata e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Rimuovere la striscia di paraffina e scuotere via l'eccesso di soluzione di blocco, aggiungendo da 50 a 100 microlitri di anticorpo primario freddo ghiacciato anti-KSHV Lana diluito nel buffer di blocco per coprire il tessuto. Ricoprire il tessuto con una nuova striscia di paraffina ed incubare nella camera umidificata per una o due ore.
Lavare i vetrini tre volte in XPBS 1x per cinque minuti. Ad ogni lavaggio aggiungere da 50 a 100 microlitri di anticorpo secondario biotinilato diluito in XPBS 1x e incubare nella camera umidificata a temperatura ambiente per 30-45 minuti. Mentre i vetrini sono in incubazione, preparare la streptavidina coniugata con perossidasi.
Utilizzando il kit daco animation duet, aggiungere 10 microlitri di soluzione A a un millilitro di 1x PBS in un tubo da 1,5 millilitri e vortexare per mescolare. Aggiungere 10 microlitri di sol游戏副本 B e vortexare nuovamente, quindi incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare i vetrini in 1x PBS 3 volte, per cinque minuti ogni lavaggio.
Come in precedenza, aggiungere da 100 a 200 microlitri di strippin coniugato con perossidasi di rafano (horseradish peroxidase) sui vetrini. Incubare a temperatura ambiente nella camera umidificata per 30-45 minuti. Lavare nuovamente i vetrini tre volte in 1x PBS per cinque minuti per ogni lavaggio.
Cinque minuti prima del termine del lavaggio, aggiungere una compressa di DAB in un tubo conico da 50 millilitri contenente 20 millilitri di 1x PBS e 25 microlitri di perossido di idrogeno al 3%. Filtrare la soluzione di DAB attraverso un filtro siringa da 0,45 micrometri, lavorando con un vetrino alla volta. Coprire il tessuto con un millilitro di soluzione di DAB sotto illuminazione in campo chiaro al microscopio ottico.
Monitorare lo sviluppo del colore per KSHV Lana nelle cellule infette finché non si raggiunge lo sviluppo cromatico desiderato. Immergere i vetrini in acqua distillata per cinque minuti per arrestare la reazione nel caso di marcatura doppia. Riprendere quindi con la rimozione dell'antigene in tampone citrato a 95 gradi Celsius, come descritto nel testo allegato, e procedere con la colorazione.
Utilizzando la stessa procedura, montare il tessuto con un mezzo di montaggio per montaggio permanente e coprire con un coprioggetto. Immagine in campo chiaro. Spesso è consigliabile inviare molti campioni individuali inclusi in blocchi di paraffina per essere perforati e disposti in una matrice microarray di tessuti per ulteriori analisi statistiche. Le cellule marroni positive per la proteina cellulare PCAM-1 (CD31), indicate da una freccia grigia, si raggruppano attorno ai vasi sanguigni.
Cellule rosse positive per la proteina virale. Le cellule contrassegnate con frecce nere indicano cellule infette dal virus dell'herpes associato al sarcoma di Kaposi. Qui è mostrata un'ingrandimento a basso potere di cellule marroni positive per la proteina cellulare pcam.
Un CD31 indicato con frecce grigie in una regione intorno ai vasi sanguigni. Cellule rosse positive per la proteina virale. Cellule contrassegnate con una freccia nera indicano cellule infette dal virus dell'herpes associato al sarcoma di Kaposi.
Ecco un campione bioptico di tessuto tumorale di KS su una microscaglia di tessuto tumorale con cellule marroni positive per la proteina virale. Lana indica cellule infette dal virus dell'herpes associato al sarcoma di Kaposi e mostra una certa formazione di cellule fusiformi. Ecco un altro campione bioptico di tessuto tumorale di KS su una microscaglia di tessuto tumorale con cellule marroni positive per la proteina virale.
Le cellule Lana indicano cellule infette dal virus dell'herpes associato al sarcoma di Kaposi con un elevato grado di formazione di cellule fusiformi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un'immunohistochimica a doppia marcatura su tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina. Durante l'esecuzione di questo esperimento, è molto importante osservare lo sviluppo del colore al microscopio e arrestare la reazione in acqua.
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Panoramica
In questo articolo si discute dell'etichettatura doppia del tessuto tumorale del sarcoma di Kaposi mediante immunohistochemia per identificare le proteine virali e delle cellule ospiti. La metodologia prevede l'esposizione degli antigeni, l'applicazione di anticorpi primari e lo sviluppo del colore per la visualizzazione. I risultati mirano a migliorare la comprensione dei fattori delle cellule ospiti nel sarcoma di Kaposi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncologia
- Immunologia
Sfondo
- Il sarcoma di Kaposi è associato all'infezione da KSHV.
- I fattori delle cellule ospiti sono cruciali per lo sviluppo del sarcoma di Kaposi.
- L'identificazione dei geni cellulari alterati può portare a nuove terapie.
- L'immunoeistochimica è una tecnica fondamentale per lo studio dei tessuti tumorali.
Scopo dello studio
- Dimostrare la tecnica di marcatura doppia per il tessuto tumorale.
- Identificare i fattori delle cellule ospiti alterati dall'infezione da KSHV.
- Fornire indicazioni per potenziali bersagli terapeutici.
Metodi Utilizzati
- Esposizione al calore per rivelare gli antigeni.
- Applicazione di anticorpi primari coniugati con biotina.
- Utilizzo del coniugato enzimatico streptavidina-perossidasi.
- Sviluppo del colore mediante substrato enzimatico.
Risultati principali
- Localizzazione riuscita di proteine virali e della cellula ospite.
- La colorazione immunohistochimica ha fornito una visualizzazione chiara.
- Identificazione di potenziali fattori della cellula ospite per un targeting terapeutico.
- Migliorata comprensione della biologia tumorale del sarcoma di Kaposi.
Conclusioni
- La marcatura doppia è efficace per lo studio del tessuto tumorale del sarcoma di Kaposi.
- I fattori delle cellule ospiti svolgono un ruolo significativo nel sarcoma di Kaposi.
- I risultati potrebbero portare a nuove strategie terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'identificazione delle variazioni nell'espressione genica delle cellule ospiti indotte dal virus dell'herpes associato al sarcoma di Kaposi (KSHV) supporta la validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci oncologici. Questo approccio consente una riduzione del rischio meccanicistica chiarificando le interazioni virus-ospite che guidano la progressione tumorale. Il metodo fornisce un'elevata affidabilità predittiva per la selezione di bersagli terapeutici nei tumori dell'endotelio vascolare e nei linfomi a cellule B.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche collegando l'infezione da KSHV a geni ospite disregolati nelle cellule endoteliali microvascolari dermiche e nel tessuto tumorale.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico mediante la conferma delle alterazioni trascrizionali tramite qRT-PCR e dell'espressione proteica tramite immunoblot e immunofluorescenza.
- Valore scientifico: Sostiene la previsione affidabile validando i risultati ottenuti in vitro in tessuti tumorali archiviati di sarcoma di Kaposi mediante immunohistochimica a doppia marcatura e microarray di tessuti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati (DMVEC e tessuto tumorale di KS) per lo screening successivo di composti mirati alle interazioni ospite-virali.
- Valore operativo: Standardizza i risultati del saggio mediante analisi con microarray, qRT-PCR e immunohistochimica a doppia etichetta, per una quantificazione riproducibile dei geni deregolati.
- Valore scientifico: Evidenzia la prontezza per lo screening fornendo letture quantitative e multimodali (trascrizionali, proteiche, di localizzazione spaziale) per una valutazione affidabile dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra la rilevanza clinica collegando le variazioni dell'espressione genica in vitro al microambiente dei tessuti tumorali del sarcoma di Kaposi.
- Valore operativo: Garantisce una continuità traslazionale dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, utilizzando tessuti archiviati e microarray di tessuti.
- Valore scientifico: Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, identificando fattori dell'ospite con potenziale utilizzo come marcatori prognostici o bersagli terapeutici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta dalla validazione del bersaglio alla validazione preclinica, supportando la verifica delle ipotesi e l'allineamento dei biomarcatori nella tumorigenesi vascolare.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi identificando i programmi di espressione genica delle cellule ospiti alterati dopo l'infezione da KSHV in cellule endoteliali.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio mediante analisi con microarray e qRT-PCR per la misurazione quantitativa delle variazioni trascrizionali.
- Analisi: Evidenzia letture multi-omiche (trascrizionali tramite qRT-PCR, proteiche tramite immunoblot/immunofluorescenza, spaziali tramite IHC con doppia marcatura) che permettono il confronto tra condizioni infette e condizioni di controllo.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica attraverso la validazione dei risultati ottenuti in vitro in tessuti tumorali di sarcoma di Kaposi archiviati, utilizzando microarray di tessuti.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile per lo studio dell'oncogenesi virale in altre neoplasie associate agli herpesvirus.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi terapeutici, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nell'oncogenesi virale.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dei flussi di lavoro di immunohistochimica doppia marcatura e qRT-PCR.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei percorsi di oncologia.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate sulla disregolazione dei fattori dell'ospite nei modelli tumorali del sarcoma di Kaposi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in immunohistochemica, sezionamento dei tessuti e tecniche di recupero dell'antigene.
- È subordinato all'accesso a tessuto tumorale di sarcoma di Kaposi fissato in formalina e inclusi in paraffina, nonché a infrastrutture per microarray di tessuti.
- Necessita della standardizzazione delle procedure di coniugazione degli anticorpi, bloccaggio e lavaggio tra diversi laboratori.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse proteine dell'ospite e antigeni virali negli esperimenti di marcatura doppia.
- Comprende limitazioni pratiche come l'eterogeneità del tessuto e la disponibilità degli antigeni nei campioni di archivio.
