Name: Nel protocollo in situ per Ali di farfalla pupa Utilizzando Riboprobes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Scopri il protocollo di ibridazione in situ con ribosonde per analizzare l'espressione genica nelle ali di pupa di Bicyclus anynana. Questo metodo ottimizzato consente studi precisi sulla biologia dello sviluppo nei Lepidotteri.

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Ringraziamo Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche supporto tecnico per assistenza per la risoluzione di questo protocollo. Ringraziamo anche William Piel per consigli su come modificare il film.

GIORNO 1 <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni: <ul><li> 10x PBS </li><li> 1x PBS </li><li> 1x PBT </li><li> DDH 2 O <ul><li> Aggiungi DEPC per lo 0,1% del volume totale e scuotere vigorosamente le soluzioni. </li><li> Autoclave. </li></ul></li><li> Fix paraformaldeide 4% - con PBS-DEPC </li><li> Soluzione di proteinasi K - presenza di un precipitato, vortice vigorosamente prima di rimuovere aliquota </li><li> Digestione di arresto Buffer </li><li> Prehybridization Buffer </li><li> 50:50 PBT: Buffer Prehybridization </li><li> Tampone di ibridazione <ul><li> Le soluzioni devono essere tenuti RNasi-free. Utilizzare vetro-ware che è stato cotto (4 ore a 250 ° C) o di plastica usa e getta. Pipette sierologiche sono molto utili per la confezione di soluzioni </li></ul></li></ul></li><li> Sezionare le ali di volta in scena pupe in PBS </li><li> Spostare le ali direttamente per risolvere il problema del buffer in pozzi di 24 piastra di coltura bene a temperatura ambiente </li><li> Fissare i dischi per 2 ore </li><li> Lavare 5 x 5 minuti in PBT </li><li> Incubare le ali per 3 minuti in soluzione proteinasi K </li><li> Sciacquare 2 x nel tampone digestione di arresto </li><li> Lavare 5 x 5 minuti in PBT </li><li> Lavare 2 x 5 minuti 50:50 PBT: PHB </li><li> Lavare 1 x 10 minuti in PHB </li><li> Incubare in PHB almeno 1 ora a 55 ° C. </li><li> Calore denaturare l&#39;RNA sonda (20-50ng necessari per pozzetto) (80 ° C per 5 minuti) e aggiungere al tampone di ibridazione (100 ul necessaria per pozzetto) </li><li> Aggiungi sonda pozzi e incubare 48 ore a 55 ° C </li></ol> 3 ° GIORNO <ol><li> Lavare 4 x 5 minuti a 55 ° C PHB </li><li> Incubare per una notte in PHB a 55 ° C </li></ol> GIORNO 4 <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni: <ul><li> Anticorpi Block Buffer </li></ul></li><li> Lavare 1 x 5 minuti 50:50 PBT: PHB </li><li> Lavare 4 x 5 minuti in PBT </li><li> Ali incubare per 1 ora nel tampone di blocco a 4 ° C </li><li> Incubare le ali in una diluizione 1:2000 di anticorpi anti-Dig notte a 4 ° C </li></ol> GIORNO 5 <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni: <ul><li> Rilevamento buffer </li></ul><ul><li> Soluzione di sviluppo - (avvolgere in pellicola) sensibile alla luce </li></ul></li><li> Lavare 3 x 5 minuti in PBT a temperatura ambiente </li><li> Lavare 7 x 5 minuti in PBT </li><li> Lavare le ali due volte nel tampone di rilevamento </li><li> Sviluppare le ali in 1 ml di soluzione in via di sviluppo - il tempo di sviluppo deve essere monitorato di volta in volta - i tempi di sviluppo possono cambiare anche quando si utilizza la stessa sonda e la soluzione di sviluppo - in genere controllo dopo 5-10 minuti e quindi aumentare gli intervalli fino a notte. Piastra deve essere avvolto in un foglio per evitare l&#39;esposizione alla luce quando non controllo di campioni. </li><li> Risciacquare cinque volte nel tampone di arresto in via di sviluppo </li><li> Montare ali. </li></ol>

<ol><li>Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+eyespot+determination+in+butterfly+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings.</a> Science. 265, 109-114 (1994).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+in+formamide+protects+RNA+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Solubilization in formamide protects RNA from degradation.</a> Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).</li>
<li>Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+hedgehog+regulatory+circuit+in+butterfly+eyespot+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution.</a> Science. 283, 532-534 (1999).</li>
<li>Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+transformation+of+the+butterfly+Bicyclus+anynana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+%28Suppl%29%22%5BJournal%5D)">Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana.</a> Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).</li>
<li>Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+insights+into+questions+of+lepidopteran+wing+pattern+homology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology.</a> BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).</li>
<li>Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+control+of+transgene+expresson+using+laser+induction+of+the+hsp70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter.</a> BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).</li>
<li>Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+function+in+butterfly+wings+and+the+evolution+of+insect+wing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns.</a> 9, 109-115 (1999).</li>
</ol>

Ottimizzazione dei protocolli esistenti In ibridazioni in situ su dischi ala larvali sono stati effettuati con successo con i dischi da Précis farfalle coenia (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. L&#39;attuale protocollo è stato adattato da un protocollo dettagliato scritto disponibili su richiesta presso il Laboratorio Carroll colorazioni ala larvale. I cambiamenti che abbiamo fatto servono ad accogliere le differenze tra i tessuti ala larvale e pupale. Durante la pupa dissezioni hindwing, la membrana pe...

<table><tbody><tr><td>Buffer di fissazione</td><td></td><td></td><td></td><td>4% Paraformaldeide in PBS</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td></td><td>0,1% Tween 20 in PBS</td></tr><tr><td>Soluzione di Proteinasi K</td><td></td><td></td><td></td><td>2,5&amp;#109;g/ml Proteinasi K in PBT</td></tr><tr><td>Buffer di arresto della digestione</td><td></td><td></td><td></td><td>2 mg/ml glicina in PBT</td></tr><tr><td>Buffer di pre-ibridazione</td><td></td><td></td><td></td><td>Per 50 ml di PHB: 12 ml di acqua trattata con DEPC + 25 ml di formammide + 12,5 ml di SSC 20x + 50 µl di Tween 20 + 500 µl di spermatozoi di salmone a 10 mg/ml (privo di Rnasi, denaturato termicamente prima dell'aggiunta alla soluzione).</td></tr><tr><td>Buffer di ibridazione</td><td></td><td></td><td></td><td>Aggiungere glicogeno a 1 mg/ml al buffer di pre-ibridazione</td></tr><tr><td>Buffer di blocco</td><td></td><td></td><td></td><td>50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA</td></tr><tr><td>Anti-DIG</td><td>Ab</td><td>Roche Group</td><td>11 093 274 910</td><td>Coniugato con fosfatasi alcalina</td></tr><tr><td>Kit di buffer per lavaggio e blocco con DIG</td><td></td><td>Roche Group</td><td>11 585 762 001</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio acquoso Crystal Mount</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0612</td><td>Mezzo di montaggio</td></tr></tbody></table>

nel protocollo in situ per ali di farfalla pupa utilizzando riboprobes

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Qui vi presentiamo, in formato video, un protocollo per ibridazioni in situ in pupa ali della farfalla Bicyclus anynana utilizzando riboprobes. In ibridazioni in situ, un pilastro della biologia dello sviluppo, sono utili per studiare i modelli spaziali e temporali di espressione genica nello sviluppo di tessuti a livello della trascrizione. Se gli anticorpi che colpiscono i prodotti proteici di trascrizione del gene non sono ancora stati sviluppati, e / o ci sono copie del gene multiple di una particolare proteina del genoma che non possono essere differenziate utilizzando anticorpi disponibili, in situs può essere utilizzato in sostituzione. Mentre un a tecnica in situ per dischi ala larvale è stato a disposizione della comunità farfalla per diversi anni, l&#39;attuale protocollo è stato ottimizzato per le ali più grandi e più fragile pupa.

Al fine di esaminare l&#39;espressione genica nel tessuto ala pupa di Bicyclus anynana, presentiamo un protocollo ottimizzato per ibridazioni in situ utilizzando riboprobes. Forniamo anche linee guida per l&#39;ottimizzazione di questo protocollo per l&#39;utilizzo in ali pupa di altre specie di lepidotteri.

Nel protocollo in situ per Ali di farfalla pupa Utilizzando Riboprobes

Presentiamo qui, in formato video, un protocollo per l'ibridazione in situ nelle ali pupali della farfalla Bicyclus anynana utilizzando ribosonde. L'ibridazione in situ...

Questo è un protocollo ceto per le ali delle farfalle allo stadio di pupa. Pertanto, iniziamo raccogliendo le pre-pupa dalla gabbia, posizionandole su un vassoio e quindi fotografando i loro esatti tempi di PPU paziente mediante la fotografia time-lapse. Ciò ci permette di eseguire le colorazioni in momenti precisi successivi alla pupazione.Questo è importante perché diversi mRNA per diverse proteine vengono espressi in momenti diversi dopo la pation. Qui stiamo dissezionando le ali del pupillo in una piastra di Petri con base in silicone, e la parte importante consiste nel rimuovere le ali e porle nella soluzione fissativa in modo che risultino molto piatte. Se non sono piatte in questa fase, non diventeranno mai più piatte.Dopo il giusto tempo di fissazione, rimuoviamo il tampone fissativo e laviamo cinque volte. Il passaggio con proteinasi K in PBT è piuttosto critico ed è utilizzato per permeabilizzare i tessuti affinché la sonda possa penetrarvi; deve essere interrotto al momento giusto mediante questi risciacqui e lavaggi. Il DNA di sperma di salmone funziona come una fonte economica di DNA per impedire che la sonda si leghi ovunque.Lo sperma è uno dei componenti del buffer di pre-ibridazione. Quindi, qui stiamo aggiungendo lo sperma al buffer di pre-ibridazione e successivamente verrà preparata una soluzione, costituita da una miscela 1:50:50 di P-B-T-P-H-B, in parti uguali di PBT e buffer di pre-ibridazione. Questa soluzione viene utilizzata come soluzione intermedia per trasferire delicatamente le ali dalla soluzione di PBT, in cui sono state immerse, alla soluzione di pre-ibridazione.Quindi esiste una fase intermedia in cui le ali verranno inizialmente immerse in questa soluzione 50 50. Qui, le ali vengono incubate in PHP per 10 minuti e successivamente ancora in PHP per un'ora a 55 gradi. Nel frattempo, prepareremo il buffer di ibridazione, costituito semplicemente dal buffer di pre-ibridazione mescolato con glicogeno.Qui stiamo aggiungendo glicogeno al PHV per preparare una piccola quantità di buffer di ibridazione; a questo buffer aggiungeremo la sonda denaturata. Stiamo quindi riscaldando un blocco termoregolato e centrifughiamo brevemente la sonda conservata a meno 20 gradi, quindi trasferiamo la quantità corretta di sonda in una provetta per essere denaturata a 80 gradi per circa cinque minuti. In questo caso stiamo denaturando due sonde contemporaneamente, quindi aggiungiamo il buffer di ibridazione alla sonda e successivamente aggiungiamo cento microlitri di miscela di sonda in ciascun pozzetto.Per completare questo passaggio, copriremo semplicemente tutte le pozzette con il perfil, poiché le ali verranno incubate per i prossimi due giorni a 55 gradi e il parfum previene l'evaporazione. Dopo due giorni di incubazione, la sonda viene rimossa lavando le ali con PHP e l'ultimo lavaggio rimane sulle ali per altre 12-24 ore. Infine, le ali vengono sottoposte a una serie di lavaggi per riportarle in soluzione PBT. Quindi, ancora una volta, utilizzando la soluzione miscelata 50 50 tra un passaggio e l'altro.In questa fase, viene aggiunta la soluzione bloccante con anticorpi alle ali e l'anticorpo anti-dig coniugato con fosfatasi alcalina viene aggiunto al PBT per ottenere una concentrazione di circa uno a 2000. Circa 300 microlitri di questa soluzione anticorpale verranno aggiunti in ogni pozzetto, quindi le ali verranno incubate in frigorifero con l'anticorpo durante la notte. Il giorno successivo, l'anticorpo viene rimosso eseguendo una serie di lavaggi con PBT, dopodiché le ali verranno risciacquate due volte nel buffer di rilevamento a temperatura ambiente.Infine, si aggiunge un millilitro di soluzione sviluppatrice in ogni pozzetto e le ali vengono rapidamente coperte con della carta d'alluminio. Dopo circa 10 minuti, si effettua un controllo e si osserva che le ali stanno iniziando ad assumere una colorazione violacea, ma sono ancora un po' chiare. Pertanto, vengono ricoperte nuovamente e, alcuni minuti dopo, si esegue un ulteriore controllo rilevando che sono diventate leggermente più scure.Si noti che le ali incubate in sonde diverse hanno mostrato un'oscuramento a tassi leggermente differenti, quindi abbiamo deciso di coprirle nuovamente e, infine, dopo 20 minuti, abbiamo deciso di arrestare la reazione con il buffer di arresto dello sviluppo. Le ali sono ora pronte per essere montate su un vetrino; aggiungiamo quindi una piccola goccia di mezzo di montaggio su un vetrino etichettato e trasferiamo le ali sul vetrino prendendole semplicemente con una pinzetta e posizionandole sulla goccia. Rimuoviamo eventuali bolle d'aria, sistemiamo delicatamente l'ala e la copriamo con un coprioggetto.In questo esperimento, utilizziamo la sonda che si lega ai trascritti del gene grail, e li osserviamo localizzati al centro del futuro modello IPO della farfalla cyclist anana durante le prime fasi dello sviluppo dell'ala pupale.

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