Toxoplasma gondii parete formazione di cisti in attivo dal midollo osseo macrofagi e condizioni Bradyzoite
12 agosto 2010
Toxoplasma gondii converte in una forma cisti in risposta a stress ambientali, che può essere imitato in modelli di colture di tessuti. Questo video mostra le tecniche per esaminare la formazione di cisti muro attivando midollo osseo macrofagi o modificare il pH medio di crescita in cellule di fibroblasti.
L'obiettivo generale di questa procedura è indurre e visualizzare la formazione della parete cistica in Toxoplasma gondii in vitro. Questo viene ottenuto coltivando prima macrofagi e fibroblasti.
E poi infettando queste cellule ospiti, le risposte allo stress del parassita possono essere indotte nell'occhio mediante shock dei fibroblasti con pH o attivazione dei macrofagi, entrambi i quali portano alla formazione della parete cistica. Infine, viene aggiunta una lectina fluorescente alle colture, che si lega alla parete cistica, consentendo la visualizzazione dei cisti mediante microscopia a immunofluorescenza. Ciao, sono Crystal Tobin del laboratorio della dottoressa Laura Noel del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia Medica dell'Università del Wisconsin di Madison.
Sono Angela Pollard, anch'io del No Lab. Oggi vi mostreremo un procedimento per la formazione in vitro della parete cistica di Toxoplasma gondii. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le risposte del parassita a condizioni di stress.
Iniziamo. Posizionare un'ansa sterile in vetro rotonda sul fondo di ogni pozzetto di una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti per indurre la conversione di Toxoplasma gondii in bradizoiti in fibroblasti umani della cute prepuziale in condizioni di pH elevato e carenza di anidride carbonica. Partire da un flacone confluenziale di 150 centimetri quadrati di fibroblasti umani della cute prepuziale, sotto cappa a flusso laminare.
Lavare due volte il matraccio confluenziale contenente fibroblasti del prepuzio umano con un XPBS, quindi aggiungere 2,5 millilitri di tripsina-EDTA 0,025%. Incubare il matraccio a 37 gradi Celsius per cinque-dieci minuti. Al termine dell'incubazione di cinque-dieci minuti, battere leggermente sul matraccio più volte per staccare le cellule dalla superficie della plastica.
Successivamente, aggiungere 150 millilitri di mezzo HFF o mezzo di Eagle modificato con delcos integrato. Utilizzare il mezzo per risciacquare la fiasca e raccogliere le cellule. Distribuire un millilitro di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente coprovetrini, quindi lasciare che le cellule raggiungano la confluenza a 37 gradi Celsius in un’atmosfera di anidride carbonica al 5%.
Le cellule saranno quindi pronte per essere infettate con il parassita Toxoplasma Gandhi. Sotto la cappa a flusso laminare, infettare un flacone da 25 centimetri quadrati contenente un monostrato confluenziale di fibroblasti umani della pelle con due volte 10 alla sesta parassiti e incubare a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule iniziano a lacerarsi. Dopo circa due o tre giorni, utilizzare un raschietto per cellule per rimuovere il monostrato di fibroblasti infetti della prepuzio dal flacone per colture cellulari.
Quindi rilasciare i parassiti dalle cellule ospiti passando il monostrato staccato attraverso un ago da 27 gauge. Utilizzare un emocitometro per determinare il numero di parassiti nel mezzo e quindi infettare da 10 alla quinta parassiti in ciascuna delle 24 pozzette di fibroblasti umani del prepuzio confluenti, precedentemente preparati.
Incubare le cellule per tre ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per consentire ai parassiti di invadere le cellule ospiti. Procedere quindi con l'induzione della conversione dei parassiti nella fase di Brady Zeolite. Rimuovere il DMEM dai fibroblasti umani della prepuzio infetti.
Sciacquarli con un XPBS e quindi aggiungere un millilitro di mezzo di sviluppo. Un mezzo a base di RPMI senza bicarbonato, aggiustato a pH 8. Incubare le cellule per tre giorni a 37 gradi Celsius in aria ambiente.
Le cellule sono ora pronte per essere analizzate alla ricerca della presenza di Brady zos. La presenza di Brady ZOS viene determinata utilizzando la lectina marcati con fluorescenza docos o DBA, che si lega alla parete dell'assist di Toxoplasma Gandhi per preparare le cellule infette all'analisi mediante imaging fluorescente. Lavare i pozzetti tre volte con un XPBS.
Successivamente, fissare i monociti cellulari con 200 microlitri di formaldeide al 3% per 20 minuti. Rimuovere il fissativo e risciacquare le pozzette con un XPBS. Aggiungere 200 microlitri di glicina 0,1 M nelle pozzette e lasciare in posa per cinque minuti.
Rimuovere la glicina e lavare le pozzette con un XPBS per bloccare e permeabilizzare le cellule. Aggiungere 250 microlitri di soluzione di blocco. Incubare le cellule per 30 minuti.
Rimuovere la soluzione di blocco e sciacquare le pozzette con un XPBS. Aggiungere 50 microlitri di una diluizione 1:250 di DBA, coniugata alla rumina, nelle pozzette. Coprire la piastra e agitare a temperatura ambiente per un'ora su un agitatore orbitale.
Dopo l'incubazione, rimuovere il DBA marcato con fluorescenza lavando le coprioggetti tre volte con Triton X-100 0,2% in PBS 1x per cinque minuti ciascuno su un agitatore orbitale, quindi montare definitivamente le coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio contenente dpi schermato al beta. La colorazione T Gandhi può essere visualizzata mediante microscopio a fluorescenza con un filtro appropriato per rot domine a un ingrandimento di 100x. Come metodo alternativo per indurre la formazione di Brady ZO, è possibile attivare i macrofagi derivati dal midollo osseo infetti con interferone gamma e lipopolisaccaride o LPS. Per iniziare, preparare innanzitutto il mezzo condizionato da L 9 29 per questo processo.
L 9 29 è un linfaggio cellulare di fibrosarcoma che, dopo lunghi periodi di confluenza, secerne il fattore stimolante le colonie di macrofagi. Questo mezzo condizionato può essere utilizzato per differenziare le cellule del midollo osseo murino in macrofagi in coltura cellulare. Per preparare il mezzo condizionato, coltivare un flacone da 150 cm² di cellule L 9 2 9 fino alla confluenza a 37 gradi Celsius. Successivamente, incubarle per ulteriori sette-nove giorni, fino a quando assumeranno un aspetto sferico e inizieranno a staccarsi dalla superficie del flacone.
Raccogliere il mezzo e tutte le cellule staccate in un tubo da 50 millilitri e centrifugare a 420 ×g per 10 minuti. Il surnatante ottenuto è il mezzo condizionato: un flacone da 150 centimetri quadrati di cellule L 9 29 produrrà 30 millilitri di mezzo condizionato, volume necessario per preparare 150 millilitri di mezzo BMC. Ricordare di preparare il DMEM per BMC con le cellule L 9 29 da utilizzare per lo sviluppo del BMC.
Per visualizzare protocolli video dettagliati che illustrano il metodo per isolare le cellule del midollo osseo. Per il femore del mouse, si prega di consultare i seguenti protocolli video dopo che le BMC raccolte sono state incubate per cinque giorni. In piastre di Petri batteriologiche, aggiungere 10 millilitri di mezzo per BMC, che conterrà mezzo condizionato proveniente da cellule L 9 2 9, in ogni piastra e incubare per altri due giorni, al termine dei quali le cellule saranno completamente sviluppate.
I macrofagi maturi derivati dal midollo osseo o BMS possono essere passati per una o due settimane dopo la maturazione. Per dividere i BMS, rimuovere il mezzo e aggiungere cinque millilitri di PBS 1X freddo incubato a quattro gradi Celsius per 30 minuti, fino a quando le cellule iniziano a staccarsi. Risciacquare le cellule dalla piastra con una pipetta sterile. Raccogliere i BMS in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare le cellule a 420,5 ×g per 10 minuti.
Risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo BMC e quindi utilizzare un emocitometro per determinare la densità cellulare di semina. Due volte 10 alla quinta BMS per pozzetto. In una piastra a 24 pozzetti contenente coprivetrini rotondi sul fondo, lasciare aderire le cellule durante la notte prima di infettarle con T Gandhi.
Le cellule in eccesso possono essere conservate in piastre di Petri per un uso successivo. Per attivare il BMS, preparare il mezzo di attivazione sonicando il LPS in un bagno a ultrasuoni per due minuti al fine di rompere eventuali aggregati. Quindi, al mezzo BMC aggiungere 100 nanogrammi per millilitro di LPS e 100 unità per millilitro di IFN gamma.
Infine, rimuovere il mezzo BMC dalle pozzette e sostituirlo con uno dei mezzi di attivazione. Incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per tre giorni. Le BMC possono essere colorate come precedentemente mostrato con fibroblasti del prepuzio.
In questi esempi, Toxoplasma gondii bradizoiti sono marcati con DBA fluorescente in fibroblasti della pelle prepuziale umana. Sotto stress di pH. La parete del cisto è marcata fluorescentemente come mostrato in questa sezione trasversale di un cisto in vitro in DMS attivati con IFN-gamma e LPS-DVA.
È presente anche una colorazione, come mostrato qui sulla superficie della vacuolo. Vi abbiamo appena mostrato come colorare in vitro Toxoplasma gondii, cisti in fibroblasti e macrofagi attivati. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di pianificare affinché parassiti e cellule ospiti siano pronti nello stesso giorno.
Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
In questo video vengono illustrate tecniche per indurre e visualizzare la formazione della parete cistica in Toxoplasma gondii utilizzando macrofagi e fibroblasti. Lo studio si concentra su come gli stress ambientali possano innescare la formazione di cisti, fenomeno osservabile mediante microscopia a fluorescenza immunologica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Immunologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- Toxoplasma gondii può formare cisti in risposta a stress ambientali.
- La formazione di cisti può essere modellata in vitro mediante tecniche di coltura tissutale.
- Macrofagi e fibroblasti fungono da cellule ospiti per il parassita.
- Lettine fluorescenti sono utilizzate per visualizzare le pareti delle cisti.
Scopo dello studio
- Indurre la formazione della parete cistica in Toxoplasma gondii.
- Visualizzare le cisti mediante microscopia a fluorescenza immunologica.
- Comprendere le risposte allo stress del parassita all'interno delle cellule ospiti.
Metodi Utilizzati
- Coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo e cellule fibroblastiche.
- Infezione delle cellule ospiti con Toxoplasma gondii.
- Induzione di risposte allo stress mediante variazione del pH o attivazione dei macrofagi.
- Applicazione di lectine fluorescenti per visualizzare le pareti cistiche.
Risultati principali
- La formazione della parete cistica è stata indotta con successo in vitro.
- La microscopia a fluorescenza ha permesso una chiara visualizzazione dei cisti.
- Sia la variazione del pH sia l'attivazione dei macrofagi hanno portato alla formazione dei cisti.
- Le tecniche dimostrate possono essere applicate a ulteriori studi su Toxoplasma gondii.
Conclusioni
- Lo studio fornisce un metodo affidabile per indurre e visualizzare cisti.
- Comprendere la formazione delle cisti può contribuire allo studio della biologia di Toxoplasma gondii.
- Queste tecniche possono essere utili per future ricerche sulle interazioni ospite-parassita.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la riduzione del rischio meccanicistico della conversione in bradizoiti di Toxoplasma gondii, un passaggio fondamentale per comprendere l'infezione cronica e il rischio di riattivazione. Modellando in vitro la formazione di cisti indotta da stress, i ricercatori possono valutare gli effetti dei composti sulle vie di persistenza del parassita. L'approccio supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e lo screening fenotipico nella fase iniziale della scoperta di interventi antiparassitari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche relative ai percorsi di risposta allo stress del parassita che regolano la differenziazione da tachizoite a bradizoite.
- Valore operativo: Fornisce un sistema riproducibile per validare funzionalmente i bersagli coinvolti nella formazione della parete cistica e nella persistenza del parassita.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera forme di bradizoiti rilevanti per la malattia con marcatori quantificabili della parete cistica, pronte per saggi.
- Valore operativo: Permette lo screening standardizzato, basato su lettura fluorescente, di composti che inibiscono o inducono la formazione di cisti in condizioni di pH controllato o attivazione immunitaria.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta lo sviluppo di modelli preclinici collegando la formazione di cisti in vitro a fenotipi di infezione cronica rilevanti per il tropismo nei tessuti nervosi e muscolari.
- Valore operativo: Facilita la valutazione allineata ai biomarcatori del carico parassitario sotto forma di cisti come parametro traslazionale dell'efficacia farmacologica nei modelli di persistenza.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fino all'identificazione del capostipite, fornendo una piattaforma per lo screening fenotipico di composti mirati alla conversione dello stadio del parassita.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di segnalazione dello stress nei parassiti e la riduzione del rischio biologico dei meccanismi di persistenza.
- Screening: Fornisce standardizzazione dei saggi e output quantitativi di fluorescenza per una valutazione affidabile dei composti in formati a 24 pozzetti.
- Analisi: Consente la misurazione della formazione della parete cistica come variabile dipendente per confrontare condizioni di stress o trattamenti con composti.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando la formazione di bradizoiti osservata nei tessuti del sistema nervoso centrale e muscolari.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio della conversione stadio-parassita dei parassiti apicomplessi in diversi tipi cellulari ospiti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fiducia predittiva nel mirare i percorsi di differenziazione del parassita, riducendo l'ambiguità meccanicistica nei modelli di infezione cronica.
- Valore operativo: Standardizzazione dell'induzione e della visualizzazione dei cisti attraverso sistemi di fibroblasti e macrofagi migliora la riproducibilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di proseguimento o interruzione identificando composti che modulano la formazione di bradizoiti, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei programmi antiparassitari.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati aggiustata per il rischio, basata sugli effetti sulla formazione della parete del cisto come biomarcatore di persistenza.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta competenza nella coltura di parassiti, nel mantenimento delle cellule ospiti e nella microscopia a immunofluorescenza.
- È essenziale l'accesso a un microscopio a fluorescenza dotato di set di filtri appropriati per la rilevazione della rodamina.
- La standardizzazione dei protocolli di attivazione con IFNγ e LPS garantisce coerenza negli esperimenti basati sui macrofagi.
- L'adattamento a diverse linee cellulari ospiti richiede la validazione della permeabilità della parete cistica e dell'accessibilità delle lectine.
- Il controllo ambientale dei livelli di CO2 e del pH è fondamentale per un'induzione riproducibile nei sistemi di fibroblasti.
