Knockdown genico mediato da RNA a forcina corta in iHSPC in vitro: un sistema di espressione shRNA basato su lentivirus Consegna in iHSPC per il knockdown dell'espressione genica specifica

Iniziare con una cellula staminale e progenitrice ematopoietica immortalizzata, iHSPC, in terreni contenenti uno specifico ormone steroideo e citochina ematopoietica, che regolano la proliferazione cellulare in uno stato indifferenziato. Aggiungere un polimero cationico adatto e vettori lentivirali.

I virus ricombinanti trasportano sequenze codificanti per RNA a forcina corta, shRNA, diretti verso uno specifico gene ospite e un gene marcatore di resistenza agli antibiotici.

Centrifuga per sedimentare cellule e virus. Durante l'incubazione, i polimeri cationici neutralizzano le cariche della membrana cellulare, migliorando il legame virale. Dopo la fusione della membrana, il materiale genetico virale e gli enzimi vengono rilasciati nel citoplasma cellulare. Il genoma virale viene trascritto inversamente, si sposta nel nucleo e si integra nel genoma ospite.

Sotto l'influenza di uno specifico promotore nel costrutto, il costrutto genico shRNA che comprende una sequenza di corrispondenza dell'mRNA bersaglio, un segmento di loop e un'altra sequenza complementare al primo, viene trascritto formando shRNA con segmento di loop di nucleotidi spaiati. Dopo la trascrizione, l'shRNA viene esportato nel citoplasma.

Una specifica ribonucleasi scinde il segmento dell'ansa, formando RNA a doppio filamento, siRNA. Il siRNA è incorporato nel complesso di silenziamento indotto dall'RNA, il RISC e i filamenti di siRNA si separano. Il complesso attivato con il filamento trattenuto complementare all'mRNA bersaglio riconosce e si lega all'mRNA bersaglio in modo specifico per la sequenza, regolando negativamente l'espressione e mediando la soppressione del gene bersaglio.

Incubare le cellule con antibiotici specifici. Le cellule stabilmente trasdotte esprimono il gene della resistenza agli antibiotici che ne consente la selezione. Rinfrescare i terreni e incubare, consentendo la proliferazione di cellule trasdotte stabilmente.