Silenziamento genico basato sulla trasfezione inversa siRNA in vitro: una procedura per fornire piccoli RNA interferenti in cellule in coltura per inattivare l'espressione genica bersaglio

Per la trasfezione inversa di piccoli RNA interferenti, o siRNA, una classe di RNA a doppio filamento, in adipociti non aderenti o cellule adipose, preparare una sospensione di siRNA che ha come bersaglio uno specifico gene codificante una proteina negli adipociti. Aggiungere un reagente di trasfezione cationico adatto a base di lipidi. Incubare la miscela per formare complessi di trasfezione attraverso interazioni elettrostatiche.

Trasferire la miscela nei pozzetti rivestiti di collagene di una piastra a più pozzetti. I complessi di trasfezione si immobilizzano sul rivestimento della piastra mediante interazioni non specifiche. Pipettare una sospensione di adipociti in pozzetti contenenti complessi di trasfezione immobilizzati. Gli adipociti aderiscono liberamente al rivestimento della piastra, aumentando il contatto fisico tra le cellule e i complessi.

Il complesso di trasfezione si fonde con la membrana cellulare e trasporta il siRNA nel citoplasma. Il siRNA, che comprende un filamento antisenso con una sequenza complementare per colpire l'mRNA e un filamento senso, è riconosciuto dal complesso di silenziamento multiproteico che induce l'RNA, o RISC. Il siRNA si lega al RISC e i filamenti si separano, con il filamento antisenso che rimane legato al complesso.

Il complesso siRNA-RISC attivato riconosce e si lega ai siti complementari sull'mRNA bersaglio. Ciò porta alla scissione sequenziale-specifica dell'mRNA da parte della proteina argonauta del complesso RISC. L'mRNA tagliato viene ulteriormente degradato dal macchinario cellulare, silenziando così l'espressione genica bersaglio.