Name: Consegna batterica di RNAi per DJ: Transkingdom RNAi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Scopri il metodo tkRNAi per la terapia del cancro utilizzando batteri non patogeni per la consegna di shRNA terapeutico. Questa tecnica supera la resistenza ai farmaci e migliora l'accumulo di chemioterapici nelle cellule tumorali.

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Il lavoro è stato sostenuto dalla concessione nr. 01GU0615 del &quot;Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).

1) Consegna batterica di shRNAs <ol><li> Prima di iniziare con la coltura batterica, si deve preparare LB-media e LB-agar. </li><li> Per la LB-medio pesare estratto di lievito (0,5% w / v), bacto triptone (1,0% w / v) e NaCl (0,6% w / v) e diluire questi componenti in acqua bidistillata. Le soluzioni preparate devono essere sterilizzati in autoclave e sono pronti per l'uso. </li><li> Per LB-agar agar bacto (1,5% w / v) deve essere aggiunto al LB-medium precedente alla sterilizzazione. </li><li> Riscaldare LB-agar nel forno a microonde fino a quando il LB-agar è completamente sciolto. Lasciar raffreddare la soluzione fino a quando la bottiglia può essere toccato con facilità senza bruciarsi. Aggiungi kanamicina (100 mg / ml) per la selezione di cloni positivi in ​​fasi successive. </li><li> Preparare LB-agar piastre a una panchina a flusso laminare (condizioni sterili) pipettando 20 ml di LB-agar soluzione in 10 cm di Petri-piatti. Lasciate raffreddare le piastre fino a quando il liquido è diventato solido. Le piastre sono ora pronti per l'uso e può essere conservato a 4 ° C. </li><li> ShRNA-encoding vettori di espressione sono trasformati in competenti E. coli ceq221 da shock termico utilizzando la procedura di CaCl 2. </li><li> Piastra i batteri trasformati su LB-agar in piastre contenenti 100 mg / ml kanamicina, chiudere il coperchio, sigillare le piastre con parafilm e coltivare a testa in giù a 37 ° C durante la notte. </li><li> Inoculare batteri culture mini con cloni positivi con la scelta di colonie cresciute con uno stuzzicadenti. Trasferire il stuzzicadenti in 7,0 ml di fresca LB-mezzo contenente 100 mg / ml kanamicina e coltivare a 37 ° C durante la notte su un agitatore a 200 giri al minuto. </li><li> Inoculare 100 ml di fresca LB-mezzo contenente 100 mg / ml kanamicina 1:100 con la cultura notte su mini in un pallone di Erlenmeyer l 1, e incubare a 37 ° C durante la notte su un agitatore a 200 giri al minuto. </li><li> Semi di 25 x 10 4 (numero di cellule inseminate dipende dalla velocità di crescita delle cellule della linea cellulare secondo; confluenza dovrebbe essere il 70-80% ~ 24 ore dopo la semina) cellule umane di carcinoma gastrico (EPG85-257RDB) per bene in 6 - piatti bene e incubare questi a 37 ° C, in atmosfera al 5% di CO 2, satura di vapore acqueo durante la notte. </li><li> Precedente infezione di cellule di cancro, oltre culture notte del tk RNAi vettore contenente E. coli sono misurati in un fotometro per determinare il diametro esterno 600. Diluire la soluzione batterica fino a una densità ottica di 0,5 si raggiunge (600 OD = 0,5 è uguale a 1,6 x 10 8 cellule batteriche / ml). </li><li> Sostituire la FCS-contenente terreno di coltura di cellule del carcinoma a cellule contro FCS-free medio 30 minuti precedenti batterica co-incubazione. </li><li> Lavare due volte i batteri con 1 x PBS, e diluire nel siero senza Leibovitz L-15 di media. </li><li> Aggiungi batteri diluito per le cellule tumorali al desiderato MOI (molteplicità di infezione = numero di cellule batteriche per cella cancro) e co-incubare i batteri e le cellule tumorali per 2 ore a 37 ° C. </li><li> Dopo 2 ore di co-incubazione le cellule tumorali sono state lavate due volte con PBS 1x x e una volta con siero contenente Leibovitz L-15 di media integrato con 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 2,5 mg / ml di amfotericina, 150 mcg / ml di gentamicina e 100 mg / ml kanamicina. </li><li> Continuare a coltivare le cellule tumorali a 37 ° C, in atmosfera al 5% di CO 2, satura di vapore acqueo. </li><li> Gli effetti del trattamento batteriche possono essere visualizzati al microscopio a fluorescenza, misurata mediante quantitativa real-time PCR, RT a livello di mRNA, e attraverso l'analisi western blot a livello di proteine, e mostrato con test funzionali come l'analisi FACS, e saggi di proliferazione cellulare. (Se voluto, queste procedure possono essere descritte in dettaglio). </li></ol> 2) Rappresentante Risultati Se il protocollo viene eseguita correttamente, i risultati dovrebbero essere paragonabili a quelli riportati di seguito. Microscopia a fluorescenza La figura 1 mostra una cellula umana carcinoma gastrico tre ore dopo il trattamento batterica (a) in confronto a una cella non trattata (b). Attorno al nucleo della cellula trattata, i batteri possono essere rilevati. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: la microscopia a fluorescenza di cellule umane di carcinoma gastrico dopo trattamento batterica (1:500) e un trattato di cellule umane di carcinoma gastrico, come controllo, DAPI-colorazione, DAPI filtro passa-banda (Λem = 640 nm), obiettivo 40x. Quantitativa real-time RT PCR Nella figura 2 un regolamento giù di MDR1 mRNA di circa il 70% (fascio nero) possono essere osservati dopo trattamento con i batteri terapeutico. Cellule parentali servire come controllo positivo a causa della mancanza di MDR1 sovraespressione. La linea cellulare 257RDB P170 contenente un plasmide che esprime anti-MDR1 shRNAs s preso come confronto diretto della tecnologia transkingdom RNAi ad altri RNAi tacere strategie. La linea di cellule non trattate resistenti EPG85-257RDB sovraespressione MDR1, la linea stessa cella trattati con batteri privi del shRNA esprimere plasmide, e questa linea di cellule trattate con i batteri terapeutico porta un plasmide che esprime anti-MRP2 shRNAs sono stati presi come controlli positivi. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: quantitativa real-time PCR, RT espressione di mRNA MDR1 dopo il trattamento terapeutico con E. coli ceq221 esprimere anti-MDR1 shRNAs (MOI 1: 500). La normalizzazione è stata effettuata utilizzando il dell'aldolasi gene housekeeping. Il rapporto MDR1/aldolase di cellule non trattate della linea cellulare EPG85-257RDB sono stati fissati al 100%. P-valori sono stati calcolati utilizzando dello studente t-test (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001). Western Blot analisi La figura 3 mostra che il MDR1 giù regolamento ha avuto luogo a livello della proteina batterica dopo il trattamento. Essa mostra la mancanza MDR1 espressione del sensibile linea cellulare di droga dei genitori (EPG85-257P), l'espressione di MDR1 non trattata linea cellulare resistente ai farmaci (EPG85-257RDB) e la MDR1 espressione del campione trattato. Un regolamento chiaro giù di MDR1 delle cellule trattate batteri possono essere osservati. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: analisi di Western Blot MDR1 livelli di espressione dei non trattati farmaco-sensibile EPG85-257P, la non trattati farmaco-resistente EPG-257RDB, e di EPG85-257RDB dopo la co-incubazione con E.. coli ceq221 + P43 MDR1. Ab primario C219 1:100 e anti-actina 1:5 000, secondaria Ab anti-topo 1:10 000. Test di citotossicità Analisi funzionale come il test di citotossicità in figura 4 sono anche indicatori per il funzionamento della RNAi transkingdom. La linea cellulare dei genitori e la linea cellulare contenente un anit-MDR1 shRNA esprimere plasmide non mostrano alcuna resistenza alla daunorubicina. La linea cellulare resistente EPG85-257RDB e due ulteriori controlli non mostrano variazioni significative nella resistenza rispetto al campione trattato con anti-batteri MDR1 shRNA esprimere in cui la resistenza alla daunorubicina potrebbe essere invertita di circa il 90%. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: test di citotossicità. Farmaco-specifici IC50-valori determinati da un test di citotossicità per la sopravvivenza delle cellule. P-valori sono stati calcolati utilizzando dello studente t-test (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001). Antracicline accumulo di test Secondo la ridotta resistenza dei campioni batteri trattati (figura 4), l'accumulo delle antracicline anti-cellule MDR1 shRNA trattati è aumentato di circa il 90% come mostrato in figura 5. La linea cellulare dei genitori e la linea cellulare 257RDB P170 mostrano un forte accumulo di daunorubicina fino al 100%. La variante resistente mostra raramente accumulo. Cellule trattate con farmaci anti-batteri MDR1 shRNA esprimere mostrano un aumento anthracyline accumulo del 90%. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: saggio di accumulazione antraciclina. Accumulo antracicline delle cellule di carcinoma 6 giorni dopo il trattamento batterica misurato mediante citometria di flusso. P-valori sono stati calcolati utilizzando dello studente t-test (* = p &lt;0,05, ** = p &lt;0,005, *** = p &lt;0,001).

<ol><li>Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs+by+transkingdom+RNA+interference+modulates+the+classical+ABCB1-mediated+multidrug-resistant+phenotype+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.</a> Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDR1%2FP-glycoprotein+%28ABCB1%29+as+target+for+RNA+interference-mediated+reversal+of+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+cancer+multidrug+resistance%3A+a+still+unsolved+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+RNA+interference+in+drug-resistant+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Fut.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers.</a> Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).</li>
<li>Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transkingdom+RNA+interference+%28tkRNAi%29%3A+a+novel+method+to+induce+therapeutic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing.</a> Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).</li>
<li>Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+classical+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+RNA+interference+%28RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi.</a> FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).</li>
<li>Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+complete+overcoming+of+MDR1%2FP-glycoprotein-mediated+multidrug+resistance+in+human+gastric+carcinoma+cells+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference.</a> Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).</li>
<li>Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+in+vivo+reversal+of+the+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+jet-injection+of+anti-MDR1+short+hairpin+RNA-encoding+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA.</a> Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).</li>
<li>Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-expressing+bacteria+elicit+RNA+interference+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.</a> Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il numero di cellule seminate per le infezioni e il MOI corrispondenti usati, dipendono criticamente sulle linee cellulari sotto osservazione e la loro velocità di crescita. Per trovare il numero di cellule ottimale per la semina, pre-esperimenti per determinare la velocità di crescita sono fortemente raccomandati. Oltre a questo, MOIS diverse dovrebbero essere testati a causa della limitata estendere a cui le cellule possono sopportare l&#39;invasione batterica senza morire di stress. Il punto ottimale di tempo in cui ...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Biochrom AG</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Biochrom AG</td><td>A2612</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco - PBS (10 x)</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>14080048</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ceq221</td><td>Cequent Pharmaceuticals Inc.</td><td></td><td>Nessun catalogo disponibile, ordine diretto</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Biochrom AG</td><td>A2710</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen GmbH</td><td></td><td>Contiene 5.000 unità di penicillina (base) e 5.000 &amp;mu;g di streptomicina (base)/ml, utilizzando penicillina G (sale di sodio) e solfato di streptomicina in soluzione salina allo 0,85%.</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Merck KgaA</td><td>1064060500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Difco Laboratories</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Difco Laboratories</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

consegna batterica di rnai per dj: transkingdom rnai

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Interferenza dell&#39;RNA (RNAi) rappresenta un meccanismo efficace per alto inibizione specifica di espressione di mRNA. Oltre alla sua potenzialità come strumento di laboratorio potente, il percorso RNAi sembra essere promettente per l&#39;utilizzo terapeutico. Per lo sviluppo di RNA interference (RNAi) a base di terapie, la consegna di RNAi-mediare agli agenti di cellule bersaglio è uno dei principali ostacoli. Una nuova strategia per superare questo ostacolo è transkingdom RNAi (tk RNAi). Questa tecnologia utilizza batteri non patogeni, ad esempio, Escherichia coli, a produrre e consegnare terapeutici a breve hairpin RNA (shRNA) all&#39;interno delle cellule bersaglio per indurre RNAi. Una prima generazione tk RNAi-mediare vettore, TRIP, contiene il promotore del batteriofago T7 per la regolazione della espressione di un shRNA terapeutiche di interesse. Inoltre, TRIP è il luogo Inv. da pseudotuberculosis Yersinia che codifica invasin, che permette di batteri naturali non invasivi per entrare β1-integrina-positivi cellule di mammifero e il gene HlyA da Listeria monocytogenes, che produce listeriolysin O. Questo enzima permette la shRNA terapeutico per sfuggire ingresso vescicole all&#39;interno del citoplasma della cellula bersaglio. Costruisce TRIP sono introdotti in un competente non patogeni ceppo di Escherichia coli, che codifica per l&#39;RNA polimerasi T7 necessari per il promotore T7-driven sintesi di shRNAs. A ben caratterizzato associata al cancro molecola bersaglio per le diverse strategie di RNAi è ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). Questo-trasportatore ABC agisce come una pompa di estrusione di droga e la media &quot;classici&quot; ABCB1-mediata multiresistenza ai farmaci (MDR) fenotipo delle cellule tumorali umane che si caratterizza per un modello specifico resistenza crociata. Diverse ABCB1 che esprimono le cellule tumorali MDR sono stati trattati con anti-ABCB1 espressione vettore shRNA cuscinetto E. coli. Questa procedura ha determinato l&#39;attivazione dei percorsi RNAi all&#39;interno delle cellule tumorali e un regolamento notevole giù del mRNA ABCB1 codifica e la corrispondente pompa di estrusione droga. Di conseguenza, l&#39;accumulazione della droga è stato migliorato nella incontaminata farmaco-resistenti le cellule tumorali e il fenotipo MDR è stata invertita. Per mezzo di questo modello i dati forniscono la proof-of-concept che tk RNAi è adatto per la modulazione di cancro associati fattori, ad esempio ABCB1, nelle cellule tumorali umane.

Per lo sviluppo di RNA interference (RNAi) a base di terapie, una nuova strategia è stata sviluppata, transkingdom RNAi (tkRNAi). Questa tecnologia utilizza batteri non patogeni per produrre e consegnare terapeutici a breve hairpin RNA (shRNA) all&#39;interno delle cellule bersaglio. Qui, tkRNAi stato applicato con successo per l&#39;inversione del classico ABCB1-mediata multiresistenza ai farmaci (MDR) delle cellule tumorali.

Consegna batterica di RNAi per DJ: Transkingdom RNAi

L'interferenza dell'RNA (RNAi) rappresenta un meccanismo altamente efficace per l'inibizione specifica dell'espressione dell'mRNA. Oltre al suo potenziale come potente strumento di laboratorio...

Nel metodo transgenico, la procedura di interferenza dell'RNA o RNAi, utilizza batteri per veicolare RNA a forcina corti o RNA mirati contro il gene di interesse MDR1 in questo protocollo all'interno di cellule tumorali, con l'obiettivo di silenziare il gene di interesse mediante RNAi. Inizialmente, batteri escherichia coli vengono trasformati con un vettore esprimente SH-RNA. Successivamente, vengono seminate cellule tumorali positive per beta1 in modo che la confluenza raggiunga il 70%-80% entro 24 ore dalla semina. Nel passaggio successivo, i batteri esprimenti S-H-R-N-A e le cellule vengono co-incubati per due ore.Infine, la co-incubazione viene interrotta mediante trattamento antibiotico delle cellule tumorali. I risultati mostrano una downregolazione del gene di interesse a livello di mRNA, proteico e funzionale, analizzata mediante PCR in tempo reale, analisi Western blot, saggi di proliferazione cellulare e saggi di accumulo del farmaco. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri procedimenti standard, come la trasfezione con S-I-R-N-A o l'uso di oligoeffetti medi, è la consegna efficace e diretta dell'irna nelle cellule bersaglio.La tecnologia Trans Kingdom RNAi, o TK RNAi, utilizza E. coli non patogeni per produrre e consegnare RNA a forcina corti terapeutici, o HRNA, all'interno di cellule bersaglio per indurre l'RNAi. Un vettore di prima generazione che media la TK RNAi, o trip, contiene il promotore del fago batterico T7 per la regolazione dell'espressione di un RNA ad hairpin corto (SH RNA) terapeutico di interesse. Inoltre, il trip contiene il locus INV di Yersinia pseudotuberculosis che codifica per l'invasina, una proteina che permette ai batteri naturalmente non invasivi di entrare nelle cellule mammifere positive per l'integrina beta 1.Tripp include anche il gene hli, A, da Listeria monocytogenes, che produce la listeriolisina O. Questo enzima permette all'HRNA terapeutico di fuoriuscire dalle vescicole di ingresso nel citoplasma della cellula bersaglio. I costrutti Trop vengono introdotti in un ceppo competente di Escherichia coli non patogeno, che codifica per la RNA polimerasi T7 necessaria per la sintesi delle SH RNA guidata dal promotore T7. I batteri e le cellule eucariotiche vengono co-incubati, consentendo ai batteri di entrare nelle cellule eucariotiche.Gli RNA SH vengono rilasciati e inseriti in un percorso di RNAi. Per iniziare questa procedura, coltivare una cultura di batteri e coli trasformati con il fattore triplo esprimente S-H-R-N-A, utilizzando una coltura notturna come descritto nel protocollo scritto allegato, il giorno precedente. Incubare i batteri con le cellule bersaglio seminando 25 volte 10 alla quattro cellule di carcinoma gastrico umano per pozzetto in piastre a sei pozzetti.Il numero di cellule seminate dipende dalla velocità di crescita della linea cellulare; pianificare il momento della semina in modo che la confluenza sia di circa il 70-80% dopo 24 ore. Dopo la semina, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un'atmosfera satura di vapore acqueo con il 5% di anidride carbonica per tutta la notte. Prima di iniziare l'infezione delle cellule tumorali, misurare la densità ottica delle colture notturne del vettore TK RNAi contenente E. coli.Determinare l'OD 600, diluire la soluzione batterica fino a un'assorbanza di 0,5 30 minuti prima della co-incubazione batterica che sostituisce il terreno di coltura cellulare contenente FCS. Sostituire il terreno delle cellule carcinoma con terreno privo di FCS durante il periodo di 30 minuti. Lavare i batteri due volte con PBS 1x mediante centrifugazione a 4.000 giri/min per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospendere in terreno privo di siero.L 15, medio fino al volume diluito originale. Una volta risospesi i batteri e completata l'incubazione delle cellule di 30 minuti, aggiungere i batteri alle cellule tumorali al multiplo di infezione desiderato o MRI, che dovrebbe essere compreso tra 1:300 e 1:700. Incubare congiuntamente batteri e cellule tumorali per due ore a 37 gradi Celsius in un'atmosfera satura di vapore acqueo con il 5% di anidride carbonica.Dopo due ore di co-incubazione, lavare le cellule tumorali due volte con PBS una volta e una volta con mezzo L 15 contenente siero, integrato con 100 unità per millilitro di penicillina, 100 microgrammi per litro di streptomicina e 2,5 microgrammi per millilitro.Amfotericina 150 microgrammi per millilitro, gentamicina e 100 microgrammi per millilitro. È possibile continuare la coltivazione delle cellule tumorali a 37 gradi Celsius in un'atmosfera satura di vapore acqueo con il 5% di anidride carbonica? Gli effetti del trattamento batterico possono essere visualizzati mediante microscopia fluorescente, misurati mediante RT-PCR quantitativa in tempo reale a livello di mRNA ed esaminati mediante analisi Western blot.Possono essere utilizzati anche saggi funzionali come l'analisi del fax e i saggi di proliferazione cellulare. Questa immagine rappresentativa è stata acquisita tre ore dopo l'incubazione di cellule di carcinoma gastrico umano con batteri esprimenti il terapeutico. I batteri S-H-R-N-A possono essere rilevati attorno al nucleo della cellula trattata.In questo esperimento, la riduzione dell'espressione del gene di resistenza multipla ai farmaci MDR1 è stata analizzata mediante PCR in tempo reale. Una riduzione dell'mRNA di MDR1 di circa il 70% può essere osservata dopo il trattamento con un batterio terapeutico. La riduzione di MDR1 si è verificata anche a livello proteico dopo il trattamento batterico.I livelli della proteina MDR1 diminuirono nel tempo rispetto alla linea cellulare di controllo. L'analisi funzionale basata sui risultati del saggio di citotossicità qui mostrato può essere utilizzata come indicatore del funzionamento dell'RNAi trans-regno, mentre una linea cellulare resistente al farmaco non risponde al trattamento antitumorale. Infettando la stessa linea cellulare con batteri trasformati con un plasmide esprimente un'RNA a interferenza corta (shRNA) anti-MDR1, si osserva sensibilità al farmaco.Infine, in un saggio di accumulo di antracicline, la linea cellulare tumorale resistente ha mostrato un ridotto accumulo del farmaco antitumorale, fenomeno osservato nelle cellule tumorali resistenti trattate con l'SHRA MDR1 una volta acquisita la resistenza. Questa tecnica può essere applicata entro 28 ore se eseguita correttamente seguendo questa procedura. Altre tecniche, come la R-T-P-C-R, possono essere applicate per rispondere a diverse domande, ad esempio sugli effetti regolatori sul gene di interesse.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere un'idea chiara su come applicare l'interferenza trans-regno di RNA mediante co-incubazione di batteri esprimenti HRNA e cellule mammifere positive al meglio.

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Biologia

RNA interference (RNAi) tecniche di gene knockdown basati sono al centro della ricerca Tribolium. Qui, forniamo una panoramica della nostra tecnica larvale RNAi in Tribolium castaneum. Larvale RNAi è una tecnica semplice, ma potente che consente di accedere rapidamente alla perdita-di-funzione di fenotipi, consentendo ai ricercatori di studiare le funzioni del gene in contesti diversi.

Larvali interferenza RNA nella Red Farina Beetle, Tribolium castaneum

Descriviamo un metodo per abbattere l'espressione genica in una popolazione crescente di cellule di E. coli utilizzando cassette di espressione di sRNA mirate alla sequenza fornite da un vettore fagemide M13.

Fago-mediata consegna di mirata sRNA Costruisce per abbattere l&#39;espressione genica in<em&gt; E. coli</em

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è uno strumento estremamente prezioso per scoprire la funzione genica. Tuttavia, la capacità di indirizzare i geni utilizzando l'RNAi durante gli stadi pre-adulti è limitata nel principale vettore umano della malaria, l'Anopheles gambiae. Descriviamo un protocollo RNAi per ridurre la funzione genica tramite iniezione diretta durante lo sviluppo della pupa.

RNAi trigger consegna in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupe

Qui, vi presentiamo i protocolli per l'allevamento di un coleottero intermedio di germi, Dermestes maculatus (D. maculatus) in laboratorio. Condividiamo anche protocolli per embrionale e genitori RNAi e metodi per l'analisi dei fenotipi embrionali per studiare la funzione dei geni in questa specie.

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle, Dermestes maculatus

In questo articolo vengono illustrate le tecniche romanzo sviluppati per la consegna orale del RNA double-stranded (dsRNA) attraverso i tessuti vascolari delle piante per interferenza del RNA (RNAi) in sap floema insetti d'alimentazione.

Metodi di consegna orale RNA double-stranded per indurre RNAi nel floema e insetti Pentatomomorfi pianta-sap-alimentazione

L'interferenza dell'RNA è una tecnica potente e ampiamente applicabile per manipolare l'espressione genica in fasi di sviluppo specifiche. Qui, descriviamo i passaggi necessari per l'implementazione di questa tecnica nel coleottero subacqueo acquatico Thermonectus marmoratus, dall'acquisizione di sequenze geniche al knockdown di geni che influenzano la struttura o il comportamento.

Interferenza dell'RNA nei Coleotteri acquatici come potente strumento per manipolare l'espressione genica in punti specifici del tempo di sviluppo

Un sistema di ricombinazione λ-rosso-mediato è stato utilizzato per creare un mutante di delezione di un piccolo microfono di RNA non codificante.

Un piccolo RNA non codificante MicC contribuisce alla virulenza nelle proteine della membrana esterna in Salmonella enteritidis

La somministrazione orale di dsRNA prodotto dai batteri, un metodo di consegna per l'interferenza dell'RNA (RNAi) che viene regolarmente utilizzato in Caenorhabditis elegans, è stato applicato con successo qui alle zanzare adulte. Il nostro metodo consente robusti studi di genetica inversa e studi vettoriali che bloccano la trasmissione senza l'uso dell'iniezione.

Somministrazione efficace di interferenza orale dell'RNA (RNAi) alle zanzare Anopheles gambiae adulte

Reverse approcci genetici si sono dimostrati estremamente utili per determinare quali geni di resistenza agli agenti patogeni sottostanti vettore nelle zanzare. Questo protocollo video illustra un metodo utilizzato dal laboratorio Dimopoulos per iniettare dsRNA in zanzare Anopheles gambiae, che ospitano il parassita della malaria. La tecnica di manipolare la configurazione di iniezione e iniezione di dsRNA nel torace è illustrato.

Protocollo per saggi RNAi in zanzare adulte (A. gambiae)

In questo video vi mostriamo una procedura per una consegna precisa biolistic dei reagenti nel tessuto vivo con una pistola romanzo gene in miniatura. Stiamo abbattendo l'espressione della molecola netrina guida degli assoni negli embrioni sanguisuga fornendo molecole di dsRNA nella parete ventrale del corpo e dei gangli di singoli segmenti.

Localizzato RNAi e di espressione genica ectopica nel Leech medicinali

Scopri il metodo tkRNAi per la terapia del cancro utilizzando batteri non patogeni per la consegna di shRNA terapeutico. Questa tecnica supera la resistenza ai farmaci e migliora l'accumulo di chemioterapici nelle cellule tumorali.

Consegna batterica di RNAi per DJ: Transkingdom RNAi

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