Silenziamento genico basato sulla trasfezione inversa siRNA in vitro: una procedura per fornire piccoli RNA interferenti in cellule in coltura per inattivare l'espressione genica bersaglio

Pipettare il siRNA con un terreno minimo essenziale migliorato da miscelare e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere il reagente di trasfezione e il terreno minimo essenziale migliorato al siRNA e pipettare per miscelare. Incubarlo per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere la miscela di trasfezione a ciascun pozzetto della piastra rivestita di collagene.

Lavare due volte le cellule nella piastra di Petri da 100 millimetri con DPBS. Aggiungere 5 volte la tripsina alle cellule, assicurandosi di coprire l'intera superficie con la tripsina. Attendere 30 secondi e rimuovere con cura la tripsina. Incubare la capsula di Petri per 5-10 minuti a 37 °C nell'incubatore.

Quindi, tocca la parabola per staccare le cellule, evitando danni alle cellule. Aggiungere 10 millilitri di DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% di FCS e 1% di penicillina e streptomicina, per neutralizzare la tripsina. Pipettare con cura il terreno verso l'alto e verso il basso per staccare le cellule e omogeneizzare la sospensione cellulare.

Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Malassez o un contatore di cellule automatizzato e regolare la concentrazione delle cellule a 6,25 x 10⁵ cellule/mL di terreno. Seminare 800 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti o 400 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente la miscela di trasfezione.

Incubare le piastre in un incubatore per colture cellulari e non disturbarle per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire con cura il surnatante con DMEM fresco senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% di FCS e 1% di penicillina e streptomicina e rimettere le cellule nell'incubatore.