In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di esaminare gli effetti sullo sviluppo del knockdown o della sovraespressione di geni in specifici sottogruppi di cellule progenitrici neuronali nella neocorteccia. Ciò si ottiene mediante elettroporazione in vivo del DNA in embrioni di ratto per trasfettare le cellule progenitrici neocorticali. In una seconda fase, la regione elettroporata viene sezionata per arricchirla per le cellule trasfettate.

Successivamente, queste cellule vengono dissociate e piastrate in vetrini da camera e coltivate. Al fine di esaminare gli effetti sia dell'alterazione genetica intrinseca che dell'applicazione di fattori esogeni, sono stati ottenuti risultati che mostrano effetti sulla crescita e sulla ramificazione dei neuriti sulla base di misurazioni quantitative utilizzando il software avision. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altre, come la trasfezione basata sui lipidi di colture neuronali primarie, è che possiamo mirare a specifici sottogruppi di cellule progenitrici neuronali.

Ad esempio, solo i neuroni glutammatergici saranno trasfettati utilizzando questo metodo. Inoltre, possiamo elettropregare nelle prime fasi embrionali e mirare ai neuroni dello strato più profondo nati precocemente, oppure possiamo elettrolitizzare nelle fasi successive dello sviluppo e mirare ai neuroni nati più tardi che sono destinati agli strati più superficiali della corteccia. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del neurosviluppo.

Ad esempio, in che modo i fattori intrinseci ed estrinseci interagiscono per influenzare la crescita e la ramificazione neuronale? Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla crescita dei processi neuronali, può essere applicato anche ad altri processi di sviluppo neurologico come la sinaptogenesi, la proliferazione cellulare e la determinazione dei solfati. Preparare un ago per iniezione come descritto nel testo allegato.

Evitare bolle riempi l'ago con DNA che esprime GFP e il gene di interesse include il verde veloce Per visualizzare le iniezioni, caricare lo spazio rimanente nell'ago con olio di mais. Collegare un pico spritzer all'ago caricato per controllare le iniezioni. Esporre le corna uterine di un ratto anestetizzato con spray gravido come descritto in precedenza.

E nel testo che accompagna questo video viene mostrata l'iniezione di embrioni E 15 qui. Identificare il sito di iniezione illuminando gli embrioni con una lampada a collo d'oca. Manipola delicatamente un embrione per trovare dove si trova la testa e individuare la sutura della linea mediana.

Usalo come punto di riferimento per trovare il ventricolo laterale. Iniettare il DNA attraverso la parete uterina e nel ventricolo laterale. Iniettare più impulsi nel ventricolo fino a riempirlo di DNA.

Il vettore determinato dal posizionamento degli elettrodi è fondamentale per determinare quale regione della neocorteccia è elettroporata. Qui l'elettrodo positivo è posizionato vicino alle posizioni mediali dorsali attraverso il cervello per colpire questa regione del proencefalo. Il posizionamento alternato degli elettrodi si rivolge ad altre regioni della corteccia, incluso il flusso corticale laterale.

Iniettare ed elettroporare ogni embrione. A sua volta, riportare le corna uterine nella cavità del corpo e chiudere l'incisione. Monitora gli animali mentre si riprendono dall'anestesia.

Qui gli animali vengono raccolti per la coltura 24 ore dopo l'elettroporazione, in modo che la GFP sia rilevabile. Rimuovere gli embrioni dall'utero del ratto eutanasia e metterli in una capsula di Petri riempita con HBSS ghiacciato con catione bivalente in una cappa a flusso di lamina. E sotto un microscopio da dissezione fluorescente, usa la pinza dumont numero cinque.

Per sezionare le cortecce. Utilizzare una pinza dumont numero tre per rimuovere le meningi, attivare la fluorescenza utilizzando un paio di forbici val. Tagliare le regioni positive alla GFP del tessuto.

Trasferire questi pezzi in una provetta conica da 50 millilitri riempita con HBSS ghiacciato senza catione bivalente. Raccogli tutti i pezzi positivi GFP nel tubo. Rimuovere l'HBSS dal tubo e sostituirlo con un millilitro di soluzione EDTA allo 0,25% di tripsina miscelata delicatamente dall'incubatore a inversione a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Rimuovere la soluzione di tripsina. Sostituirlo con un mezzo di placcatura compreso tra uno e cinque millilitri a seconda della quantità di tessuto positivo alla GFP. Usando una pipetta stripette da due millilitri, si mangiava da cinque a sette volte per dissociare le cellule.

Contare le cellule utilizzando un emocitometro diluito con terreno di placcatura a una concentrazione da due a 3,5 volte 10 per le cinque cellule per 1,5 millilitri di piastra media 1,5 millilitri in ciascuna camera di una camera CC a due rivestimenti. Diapositiva. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro ore per consentire alle cellule di aderire ai vetrini. Aspirato, il terreno di placcatura aveva 1,5 millilitri di terreno neuronale per coltura camerale.

Le cellule a 37 gradi Celsius allo stadio desiderato prima di procedere con l'immunocolorazione. Per misure di processo neuronale. La cultura dei tempi di crescita varia tra 24 ore e sette giorni.

In una cappa aspirare il terreno da ciascuna camera di coltura. Fissare le cellule con il 4% di formaldeide per 15 minuti. Lavare due volte rapidamente con una volta PBS prima del blocco e immuno visto nelle colture come descritto nel testo di accompagnamento Montare le colture con un mezzo di montaggio fluorescente e un vetrino coprioggetto.

Visualizza le colture a 20 x con un microscopio a fluorescenza. Registra immagini di neuroni positivi alla GFP per l'analisi. Abbiamo scoperto che con questa tecnica, circa il 75% dei cervelli elettroporati è mirato alla regione desiderata della corteccia, sia che si tratti della corteccia mediale dorsale che della corteccia laterale ventrale.

Abbiamo trovato l'elettroporazione precoce a E da 13 a 14 neuroni dello strato profondo bersaglio come TBR, uno strato positivo sei neuroni, mentre l'elettroporazione successiva bersaglio CT IP due TBR positivi uno strato negativo cinque cellule ancora più tardi l'elettroporazione bersaglio BRN due strato positivo due slash tre cellule. Qui mostriamo le sezioni coronali del cervello elettroporate al giorno embrionale 15,5 o 17,5 e raccolte al quinto giorno postnatale. In coltura, la percentuale di cellule che A GFP positivo può variare notevolmente a seconda di quanto si è prudenti quando si seziona la regione GFP positiva.

Tuttavia, anche quando siamo molto prudenti e sezioniamo solo il patch di celle positivo alla GFP, la percentuale più alta che osserviamo è compresa tra il 5 e il 10%. Questa bassa efficienza di trasfezione è utile per identificare quali processi appartengono alla cella elettroporata che si sta analizzando. La placcatura delle cellule a questa densità più elevata contribuisce ad avere colture più sane. Tuttavia, è difficile discernere quale processo appartiene a quale corpo cellulare nelle cellule GFP negative.

Seguendo questa procedura, l'immunocolorazione può essere eseguita per diversi marcatori al fine di rispondere a domande riguardanti la proliferazione, la sinaptogenesi e la determinazione del solfato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare reagenti e strumenti sterili per prevenire la contaminazione e l'infezione Una volta padroneggiata. Ogni aspetto di questa tecnica può essere eseguito in due o tre ore se eseguito correttamente.

Quindi questo è tutto. Grazie per l'attenzione. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.