Name: In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Scopri l'elettroporazione in utero per studiare la funzione genica in sottoinsiemi di neuroni corticali usando embrioni di ratto. Questo metodo consente analisi quantitative della crescita e ramificazione dei neuriti.

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Gli autori desiderano ringraziare Giuseppe LoTurco e Dennis Selkoe per le discussioni utili su questa tecnica. Gli autori ringraziano i donatori della Fondazione Americana Assistenza Sanitaria, per il supporto di questa ricerca.

Il protocollo di base per l'elettroporazione in utero è stata descritta in dettaglio in un altro articolo JOVE dal laboratorio Kriegstein 1, 2. Questa tecnica è stata originariamente descritta nel laboratorio Osumi 3 e il nostro protocollo si basa su quello sviluppato nel laboratorio LoTurco 4. Vi forniremo una panoramica del nostro protocollo di elettroporazione in utero di embrioni di ratto, concentrandosi sui dettagli più importanti, seguita da una descrizione del nostro protocollo che si applica in elettroporazione utero allo studio della funzione dei geni nella crescita processo neuronale. 1. Elettroporazione in utero <ol><li> Preparazione aghi DNA e di carico Il primo passo per electroporations in utero è quello di progettare l'esperimento per determinare quali costruisce il DNA da iniettare. Questo metodo è utile sia per misexpressing o abbattere i geni di interesse. Se state pensando di misexpressing o sovraespressione di un gene, assicurarsi di utilizzare un promotore che è attiva nelle cellule precursore neuronali. Si consiglia il promotore CAGGS, che consiste del promotore pollo beta-actina e il potenziatore CMV 5. Poiché solo un piccolo sottoinsieme di cellule sono transfettate con elettroporazione in utero, è fondamentale per includere un plasmide codifica una proteina fluorescente GFP, come in modo da poter seguire quelle cellule che sono state con successo elettroporate. Per la GFP codifica plasmide, si consiglia di preparare il DNA ad una concentrazione di 0,5 mg per microlitro. Per i costrutti shRNA, abbiamo scoperto che 0,5-1,0 g per i risultati microlitri efficiente abbattere del gene di interesse. Per sovraespressione o misexpression, usiamo tra 1,0 e 3,0 mg per microlitro, a seconda delle dimensioni del gene e il livello di espressione che l'esperimento richiede. DNA sono preparati utilizzando una endotossina-free kit di preparazione Qiagen, e diluito in 1 x PBS. Noi iniettare circa 0,5-1,0 microlitri per cervello embrionale, così, per una cucciolata di animali che preparare 10 ml di miscela di DNA per l'iniezione. Si aggiunge 1 ml di Green veloce al DNA in modo da poter seguire il DNA iniettato. Tirando aghi per la forma corretta è un passo critico. Walantus et al. Usa un sistema diverso per la consegna del DNA e quindi la loro preparazione ago è anche slighly diverso 1,2 allora la nostra. Le impostazioni che si utilizza per tirare il vostro aghi dipende dalla marca di aghi estrattore che hai. Noi usiamo modello 750 da David Kopf. Le impostazioni da noi utilizzati sono: Heat 1: 9.0, Heat 2: 0, Soleniod: 0, dimensione filamento 3,0 mm, di prossimità riscaldamento: 3 mm, Tempo: 10 sec. Una volta tirato, abbiamo tagliato il nostro aghi con una lametta in una ~ angolo di 45 gradi in modo che la distanza tra la maggior parte dell'apertura alla punta è di 11 mm. Siamo quindi caricare il DNA dal backend dell'ago. Abbiamo poi riempire lo spazio rimanente nella ago con olio di mais. Per l'iniezione del DNA, usiamo un Picospritzer III. A seconda della coppia conica esatto che viene tagliato per ciascun ago, abbiamo impostato il Picospritzer 4,0-6,0. Usiamo un pedale per fornire l'aria pressurizzata che espelle il DNA dall'ago. </li><li> Preparazione degli animali per la chirurgia Noi usiamo esenti da organismi patogeni ratti Sprague Dawley esclusivamente per questi interventi. Diversi altri laboratori uso topi di varia genotipi pure. Qui, descriviamo mostrare il nostro protocollo per l'elettroporazione di E15 embrioni di ratto, ma in utero elettroporazione viene eseguita di routine nei ratti di età compresa tra E13 e E18. Mentre elettroporazione fase iniziale obiettivi strati profondi della corteccia, poi electroporations fase target strati più superficiali. Gli animali sono dato un pre-operatoria dose di buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg) prima della chirurgia ha inizio. Ci sono opzioni multiple per anestetizzare l'animale. Walantus et al. Isofuorane utilizza inalazione, mentre noi abitualmente uso iniezione intraperitoneale di ketamina (40-80 mg / kg) e xilazina (5-10 mg / kg) 1,2. Un pizzico punta deve sempre essere eseguita per assicurare che gli animali siano completamente anestetizzati e non risponde. Gli animali sono tenuti al pad riscaldato per tutta la procedura chirurgica. Pelliccia dell'animale è rasato nella regione di incisione, e lavati tre volte con etanolo seguito da tre volte con lo iodio. Un'incisione è fatta nella pelle appena lateralmente alla linea mediana, seguita da una incisione nel muscolo. Le corna uterine sono esposti con molta attenzione. Sono gentilmente preso in giro dalla cavità del corpo con la punta delle dita. Mantenere gli embrioni idratata con PBS sterile mentre sono al di fuori della cavità del corpo. </li><li> Iniettando il DNA ed elettroporazione Al primo avvio di eseguire questi interventi, la parte più difficile è acquisire familiarità con cui è necessario iniettare il DNA in modo che si riempiono i ventricoli laterali, e abituarsi a quanto in profondità si inietta l'ago per colpire la regione corretta. Embrioni vengono delicatamente manipolate con la punta delle dita in modo che possiate identficare dove la testa è, e se si guarda attentamente si sarà in grado di vedere la sutura linea mediana. Questo serve come punto di riferimento generale che è possibile utilizzare per determinare dove il ventricolo laterale si trova. Noi iniettare il DNA attraverso la parete uterina e nel ventricolo laterale. Usiamo un pedale per controllare l'iniezione del DNA - impulsi multipli del DNA sono effettuati fino a quando il ventricolo laterale è pieno il DNA / miscela colorante. Abbiamo poi posizionare gli elettrodi pagaia su entrambi i lati della testa dell'embrione e utilizzare un altro pedale per fornire l'impulso attraverso la testa di un embrione. Il posizionamento degli elettrodi è fondamentale nel determinare quale regione della corteccia è elettroporate. Dal momento che il DNA è carico negativamente, il DNA si sposterà verso l'elettrodo positivo quando una carica viene dissipato attraverso le pale. A seconda della posizione esatta degli elettrodi, diversi sottoinsiemi di cellule saranno mirati. Noi abitualmente posto l'elettrodo positivo vicino al dorso-mediale posizioni in tutto il cervello. Tuttavia, il laboratorio LoTurco splendidamente mostrato che se si mette gli elettrodi nelle regioni più ventrale laterale del cervello è possibile indirizzare le cellule del cortico-striatale cellule confine e ha colpito del flusso laterale corticale 6. Ogni embrione può essere elettroporate, e diverse combinazioni di costrutti di DNA possono essere utilizzati in ogni embrione. </li><li> Sutura e post-operatorio A seguito di elettroporazione di tutti gli embrioni, le corna uterine sono accuratamente restituite alla cavità del corpo, ed entrambi lo strato muscolare e la pelle sono suturate. La tecnica per questo è indicato nella Walantus et al 1,2. Gli animali sono costantemente monitorati fino a quando non recuperare da anestesia, e la buprenorfina analgesico (0,05-0,1 mg / kg) è somministrato ogni 8-12 ore. </li></ol> 2. Coltura elettroporate neuroni corticali <ol><li> La raccolta cervelli elettroporate e sezionare regione elettroporate Per le analisi in vivo dopo l'elettroporazione in utero, gli animali possono essere raccolti in un punto qualsiasi momento da 24 ore dopo l'elettroporazione ai primi dopo la nascita fino all'età adulta. Tuttavia, quando i neuroni coltura primaria abbiamo raccolto 24 ore dopo l'elettroporazione in E16. A questo punto, gli embrioni elettroporate esprimono livelli rilevabili di BPA. Gli animali sono l'eutanasia con l'inalazione di biossido di carbonio e decapitazione rapida. Gli embrioni vengono sezionati fuori dell'utero e messo in HBSS con cationi bivalenti, tenendo traccia dei quali embrioni sono stati elettroporate con cui plasmidi DNA. E 'fondamentale utilizzare HBSS filtrata, provette sterili e piatti, e gli strumenti in autoclave per la dissezione. Le cortecce vengono sezionati fuori e le meningi rimosso utilizzando un microscopio in un cappuccio. Queste cortecce vengono poi osservati al microscopio dissezione con la capacità di visualizzare GFP. Regioni GFP positive della corteccia sono stati identificati, e noi ue un paio di forbici Vanna per tagliare le regioni GFP positive da parte della corteccia. Questi pezzi sono posti in HBSS senza cationi bivalenti in un tubo da 15 ml. </li><li> Dissociare e placcatura neuroni Una volta che tutte le regioni GFP positive sono sezionati, HBSS viene sostituito con 0,25% tripsina, e incubate a 37 ° per 5 minuti. Tripsina viene rimosso, sostituito con terreni in piastra (DMEM + 5% FBS + Penn / strep glutammina +), e triturato 5-7 volte a dissociare le cellule. Volumi utilizzati dipendono dalla quantità di tessuto presente. Cellule dissociate sono poi placcato in CC2 diapositive camera rivestita. Per i due scivoli da camera, abbiamo piastra 200,000-350,000 cellule per camera in un volume di 1,5 ml di terreni in piastra. Dopo 4 ore, terreni in piastra è aspirato e sostituito con 1,5 ml di terreni di coltura neuronale (Neurobasal supporti + B27 + supplemento glutamax + gentamicina) per camera. </li></ol> 3. Analizzando escrescenza neuronale processo <ol><li> Fissaggio e immunocolorazione culture Al fine di misurare effecs breve termine della manipolazione genetica di queste cellule, raccogliamo i neuroni primari dopo tre giorni in vitro. Se i neuroni primari sono di essere colti più per ulteriori analisi, la metà dei media dovrebbero essere sostituiti ogni tre giorni. Per il fissaggio delle culture, abbiamo aspirare i media dalle camere, e fissare i neuroni nel 4% paraformaldhyde per 15 minuti. Fissazione seguito, le cellule vengono lavate due volte in PBS e poi mettere in soluzione bloccante (siero asino 2% con 0,1% Triton X-100 in PBS) per un'ora. Le cellule vengono poi incubate in anticorpo primario per 1 ora. Per le analisi della crescita degli processo neuronale, si usa anticorpi anti-beta tubululin per identificare i neuroni - immunocolorazione beta tubulina II etichette neruonal il corpo cellulare, dendriti e assoni. Le cellule vengono poi lavate tre volte in PBS per cinque minuti, e poi incubate in Cy3-anti topo per 1 ora, seguita da altri tre lavaggi PBS, controcolorazione nuclei con DAPI e montaggio. </li><li> Misura neurite lunghezza Immagini di GFP positive, beta-tubulina III neuroni positivi sono invece acquistati su Axioskop Zeiss con un sistema di MC100 telecamera. Diverse variabili possono essere esaminate in queste cellule GFP positive tra cui la lunghezza di tutti i neuriti, lunghezza del più lungo dei neuriti, ramificazione dei neuriti, la dimensione del soma cellulare, ecc Abbiamo usato questo metodo per analizzare escrescenza sul processo neuronale abbattere o sovraespressione di geni relative al neurosviluppo e neurodegenerazione, con particolare attenzione alla lunghezza del processo neuronale. Al fine di misurare i processi neuronali escrescenza, usiamo AxioVision LE 4,4 software (dalla Zeiss). All'interno di questo software, è disponibile un'opzione per selezionare lo strumento "bozza". Con questo strumento, è possibile utilizzare il mouse del computer per tracciare la lunghezza di ogni processo neuronale. È fondamentale per definire l'obiettivo che si sta utilizzando al fine di ottenere una misura accurata del tuo neuriti. Per queste analisi, di solito usare un obiettivo 20x. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Abbiamo scoperto che Sprague Dawley numero dei nati varia tra i 6 ei 14 embrioni. Noi di solito electroporate tutti gli embrioni. Ogni embrione può essere elettroporate con una diversa combinazione di DNA. Tuttavia, di solito electroporate almeno quattro cervelli con la stessa condizione e la piscina questi cervelli prima di dissociazione e placcature. Abbiamo scoperto che con questa tecnica circa il 75% dei cervelli elettroporate sono mirati alla regione desiderata della corteccia, sia che si tratti dorsale della corteccia mediale o ventrale laterale (Figura 1). Inoltre, abbiamo trovato electroporations presto al E13-14 neuroni livello di destinazione profonde come Tbr1 neuroni positivi strato VI, mentre dopo electroporations target positivo CTIP2, TBR1 negativo cellule V strato, e più tardi ancora bersaglio electroporations Brn2 positivo strato II / III cellule. Un'eccellente descrizione di marcatori diversi e la spiegazione delle specifiche sottotipo neuronale nella corteccia trovato in un articolo di Moleneaux et al 7. La Figura 2 mostra sezioni coronali del cervello elettroporate alle due giorni embrionale 15,5 o 17,5 e raccolte al giorno dopo la nascita 5. Visualizzati in rosso è immunocolorazione per Oct6. Potete immunostain per i marcatori di cultura per confermare ciò che le popolazioni strato di cellule che hanno preso di mira. Abbiamo scoperto che ci si può aspettare di indirizzare la stessa popolazione strato di cellule di cellule in ogni embrione della stessa cucciolata (in altre parole, l'orientamento dipende dalla timepoint embrionale piuttosto che su altre variazioni tecniche). Nella cultura, la percentuale di cellule che sono GFP positive possono variare notevolmente a seconda di come conservatore voi quando sezionare la regione positivo GFP (Figura 3). Tuttavia, anche quando siamo molto conservatori e sezionare solo la patch di cellule GFP positive, la percentuale più alta che osserviamo è il 5-10% - anche se sono sezionare la regione della corteccia che è stato elettroporate, le cellule in un solo strato si essere mirati. Questo effciency trasfezione bassa è utile per identificare i processi che appartengono alla cella electoporated che si sta analizzando. Cellule placcatura in questa densità più elevata contribuisce ad avere heathier culture, tuttavia, è difficile capire quale processo appartiene a quale corpo cellulare nelle cellule GFP negativo (Figura 3). Se avete problemi a vedere tutti i processi belle delle cellule elettroporate, è possibile aumentare la concentrazione di DNA GFP che si sta electroporating per aumentare l'espressione di GFP, oppure si può immunostain le cellule dissociate utilizzando un anticorpo anti-GFP (da Invitrogen ) con un anticorpo Cy2 secondario. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. E15.5 ratti Sprague-Dawley sono stati elettroporate con plasmide GFP e raccolto tre giorni dopo. Sulla base del posizionamento degli elettrodi, diverse regioni della corteccia saranno mirati. AF mostrano fluorescenza GFP nel cervello intero. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. E15.5 (A) o E17.5 (B) ratti Sprague-Dawley sono stati elettroporate con GFP plasmide e raccolta al giorno dopo la nascita 5. Cervelli sono stati fissati, sezionati coronale utilizzando un vibratome (100 sezioni micron), e immunostained per Oct6 (rosso). A e B mostrano le immagini confocale di sezioni immunostained. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. E15.5 ratti Sprague-Dawley sono stati elettroporate con plasmide GFP. 24 ore dopo l'elettroporazione, i cervelli sono state raccolte e GFP-positive, le regioni elettroporate sono stati sezionati e dissociato, come descritto nel video. Dopo 3 giorni in vitro, le cellule sono stati fissati e immunostained per bIII-tubulina (rosso) e la colorazione dei nuclei con DAPI (blu) (A, C). La lunghezza del più lungo neurite è stata misurata utilizzando il software AxioVision(B, D).

<ol><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).</li>
<li>Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).</li>
<li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).</li>
<li>Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DCX+and+LIS1+in+migration+through+the+lateral+cortical+stream+of+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain.</a> Dev Neurosci. , 144-156 (2008).</li>
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<li>Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Function+for+-Amyloid+Precursor+Protein+in+Neuronal+Migration+Revealed+by+In+Utero+RNA+Interference%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference.</a> J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).</li>
<li>Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+APP+regulates+the+function+of+full-length+APP+in+neurite+outgrowth+through+interaction+with+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Develop%22%5BJournal%5D)">Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1.</a> Neural Develop. 3, 15-15 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Studio in vitro su colture primarie neuronali consentono di analisi quantitative di crescita dei neuriti. Al fine di studiare come le alterazioni genetiche influenzano escrescenza processo neuronale, costrutti shRNA o misexpression può essere introdotto in neuroni primari tramite trasfezione chimici o trasduzione virale. Tuttavia, con primarie cellule corticali, un pool eterogeneo di tipi di cellule (neuroni glutamatergica da diversi strati, neuroni inibitori, cellule gliali) sono transfettate con questi metodi...

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks 10X (HBSS) (senza Ca&amp;rsquo;&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; /Mg &lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt;)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks 10X (HBSS) (con Ca&amp;rsquo;&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; /Mg &lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt;)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M, pH 7,4</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri 100 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri 60 x 15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62-547-205</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62-554-205</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinze standard</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinze curve</td><td>Fine Science Tools</td><td>11273-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25%</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro Reichert Bright-Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Contatore manuale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z169021</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo Dulbecco&amp;rsquo;s modificato di Eagle (D-MEM)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960-051</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo NEUROBASAL</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Supplemento privo di siero B-27</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Supplemento GlutaMAX-I</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione reagente di gentamicina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Siero di asino</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti beta-III tubulina</td><td>Chemicon International</td><td>MAB1637</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti MAP2</td><td>Chemicon International</td><td>AB15452</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Cy3 anti-topo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-166-151</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Cy2 anti-pollo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-226-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini con camere rivestiti CC2</td><td>Lab-Tek</td><td>154852</td><td></td></tr><tr><td>Mezzi di montaggio fluorescenti</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti microscopici 24 x 60 mm</td><td>VWR international</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Smalto trasparente per unghie</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Chetamina</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore a onde quadre BTX</td><td>Fisher Scientific</td><td>BTXECM830</td><td></td></tr><tr><td>Tweezertrodi, 7 mm, platino</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450488</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero elettroporazione seguita da primaria cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Studio in vitro su colture primarie neuronali permette di analisi quantitative di crescita dei neuriti. Al fine di studiare come le alterazioni genetiche influenzano escrescenza processo neuronale, shRNA o costrutti del DNA può essere introdotto in neuroni primari tramite trasfezione chimici o trasduzione virale. Tuttavia, con primarie cellule corticali, un pool eterogeneo di tipi di cellule (neuroni glutamatergica da diversi strati, neuroni inibitori, cellule gliali) sono transfettate con questi metodi. L&#39;uso di elettroporazione in utero ad introdurre i costrutti del DNA nella corteccia roditori embrionale permette di alcuni sottoinsiemi di cellule su cui agire: mentre elettroporazione dei primi strati embrionali obiettivi corteccia profonda della corteccia, elettroporazione a tarda timepoints embrionale obiettivi strati più superficiali. Inoltre, il posizionamento differenziale di elettrodi sulle teste dei risultati della singola embrioni nel individuazione delle regioni dorso-ventrale mediale contro-laterale della corteccia. A seguito di elettroporazione, le cellule trasfettate possono essere asportate, dissociato, e placcato in vitro per l&#39;analisi quantitativa di crescita dei neuriti. Qui, forniamo un passo-passo metodo per misurare quantitativamente escrescenza neuronale processo in sottoinsiemi di cellule corticali. Il protocollo di base per l&#39;elettroporazione in utero è stato descritto in dettaglio nei due articoli JOVE altri dal laboratorio Kriegstein 1, 2. Vi forniremo una panoramica del nostro protocollo di elettroporazione in utero, concentrandosi sui dettagli più importanti, seguita da una descrizione del nostro protocollo che si applica in elettroporazione utero allo studio della funzione dei geni nella crescita processo neuronale.

Elettroporazione in utero è un metodo prezioso per trasfezione delle cellule progenitrici neuronali in vivo. A seconda del posizionamento degli elettrodi e la timepoint sviluppo di elettroporazione, alcuni sottoinsiemi di cellule corticali può essere mirati. Cellule bersaglio può quindi essere analizzato in vivo o in vitro per gli effetti di alterazione genetica.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

Lo studio in vitro di colture neuronali primarie consente l'analisi quantitativa della crescita dei neuriti. Al fine di studiare come le alterazioni genetiche influenzino...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è esaminare gli effetti dello sviluppo derivanti dall'abbassamento o dalla sovraespressione di geni in specifici sottogruppi di cellule progenitrici neuronali nella neocorteccia. Questo risultato si ottiene mediante elettroporazione in vivo di DNA in embrioni di ratto per trasfettare le cellule progenitrici neocorticali. Come secondo passaggio, la regione elettroporata viene dissezionata al fine di arricchire le cellule trasfettate.Successivamente, queste cellule vengono dissociate e seminate su vetri camera e coltivate. Al fine di esaminare gli effetti sia delle alterazioni genetiche intrinseche sia dell'applicazione di fattori esogeni, sono stati ottenuti risultati che mostrano effetti sulla crescita e sul ramificarsi dei neuriti, basati su misurazioni quantitative effettuate mediante software avision. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altre, come la trasfezione mediata da lipidi di colture neuronali primarie, è la possibilità di indirizzare specifici sottoinsiemi di cellule progenitrici neuronali.Ad esempio, solo i neuroni glutammatergici verranno trasfettati utilizzando questo metodo. Inoltre, possiamo eseguire l

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In Utero iniezione intraventricolare e Elettroporazione di E15 embrioni di topo

Questo protocollo delinea i passaggi necessari per analizzare, attraverso trasfezione elettroporazione e neuroni dell'ippocampo e del mouse cultura corticale. Colture a breve termine possono essere utilizzati per gli studi della crescita degli assoni e la guida, mentre a lungo termine le culture possono essere utilizzati per studi di sinaptogenesi e analisi spine dendritiche.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

Un metodo di trasferimento genico nel cervello del mouse di sviluppo è descritta utilizzando un metodo unico chirurgico e la forma speciale di elettrodi. Questa tecnica unica consente la trasfezione di DNA plasmidico temporalmente e spazialmente, che aiuterà molti neuroscienziati a studiare lo sviluppo del cervello.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

Per condurre una rapida valutazione della funzione dei geni nello sviluppo della corteccia cerebrale, si descrivono i metodi che comportano...

Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

Questo protocollo descrive un procedimento di espianto che...

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

Questa procedura mostra come indirizzare gli interneuroni nel prosencefalo del topo in via di sviluppo per mezzo dell'elettroporazione in utero. Questa tecnica è stata particolarmente efficace per ottenere l'espressione genica selettiva nei sottotipi di interneuroni destinati agli strati superficiali della corteccia.

Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni

Questo manoscritto fornisce protocolli che utilizzano in utero elettroporazione (IUE) per descrivere la connettività strutturale dei neuroni a livello di singola cellula e l'eccitabilità dei neuroni fluorescente. Istologia è utilizzato per caratterizzare dendritiche e le proiezioni assonali. registrazione a cellula intera a fette acuta viene utilizzato per studiare l'eccitabilità.

Elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

La doppia elettropozione in utero consente di colpire le popolazioni cellulari separate spazialmente e temporaneamente. Questa tecnica è utile per visualizzare le interazioni tra quelle popolazioni cellulari utilizzando proteine fluorescenti in condizioni normali, ma anche dopo esperimenti funzionali per perturbare i geni di interesse.

Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente

Scopri l'elettroporazione in utero per studiare la funzione genica in sottoinsiemi di neuroni corticali usando embrioni di ratto. Questo metodo consente analisi quantitative della crescita e ramificazione dei neuriti.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali (Video) | JoVE Journal

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

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