Visualizzazione dei nervi larvali segmentale in 3 ^Rd Instar Drosophila I preparativi larvali

Il trasporto assonale può essere studiato visualizzando i nervi segmentali larvali. Una drosofila di terzo stadio. La larva viene prima sezionata, esponendo il SNC senza danneggiare i lobi ottici, il ganglio ventrale e i nervi segmentali.

Il secondo passo della procedura consiste nel fissare la lava in formaldeide prima di incubare con l'anticorpo primario durante la notte e l'anticorpo secondario per un'ora al buio. La lava viene quindi montata su un vetrino e presenta difetti di trasporto assonale. La localizzazione e la distribuzione delle proteine possono essere esaminate attraverso la microscopia a immunofluorescenza.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul trasporto assonale, può essere applicato anche ad altri sistemi come la sinapsi e la morfologia muscolare. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché inizialmente è difficile eseguire questa dissezione consentita, soprattutto per mantenere intatti i nervi segmentali e i muscoli del cervello. Per iniziare questa procedura, preparare una volta il fissativo del tampone di dissezione, una volta il PBT e la soluzione al 5% di BSA.

Come dettagliato nella tabella mostrata prima della dissezione, raccogliere un paio pulito di bicipiti numero cinque, un paio di forbici a ventaglio a lama dritta pulite e perni per iniziare la dissezione, utilizzare un micro cucchiaio per raccogliere il vagabondaggio. Terzo in larve stellate con un genotipo specifico su una capsula di Petri. Quindi lavare le larve sciacquandole in una capsula di Petri riempita con acqua deionizzata per eliminare tutto il cibo.

Quindi posiziona una lava sul piatto di guardia S con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Appunta la lava nella parte anteriore e posteriore. Le estremità posizionano una goccia del tampone di dissezione una tantum sulla lava appuntata usando le forbici sottili.

Stroncare la lava sulla linea mediana dorsale vicino all'estremità posteriore. Usando le forbici, taglia la cuticola di lava dall'estremità posteriore fino all'estremità anteriore. Posizionare una goccia di nuovo tampone di dissezione una volta sulla lava sezionata.

Usando uno spillo, prendi un bordo laterale della cuticola vicino al centro della lava e appunta la cuticola usando un altro spillo. Spilla. Il secondo bordo laterale della cuticola, due perni vengono utilizzati su ciascun lato come mostrato nel diagramma. Ora, rimuovete con cura l'intestino e i corpi adiposi e traia lasciando solo il cervello con i due lobi ottici e i gangli ventrali.

Con i nervi segmentali attaccati, la fissazione e la colorazione degli anticorpi vengono quindi eseguite con le larve attaccate al piatto di protezione. Incubare le larve sezionate in 50 microlitri di fissativo per 30 minuti. Sostituendo il fissativo ogni 15 minuti dopo la fissazione, sciacquare le larve in una sola volta PBT per 30 minuti.

Sostituendo il tampone ogni 10 minuti, è importante notare che le larve devono essere sempre immerse nel tampone. Preparare la soluzione di anticorpi primari diluendola alla concentrazione appropriata nella soluzione di BSA al 5%. Le concentrazioni ottimali differiscono per i diversi anticorpi.

Costruisci una camera umida foderando un piatto di plastica con Kim. Pulire imbevuto d'acqua. Sostituire l'ultima volta PBT.

Sciacquare con la soluzione di anticorpi primari preparata e incubare nella camera umida a quattro gradi Celsius durante la notte del giorno successivo. Sciacquare le larve sezionate in una sola volta PBT per 30 minuti sostituendo il tampone ogni 10 minuti. Preparare l'anticorpo secondario diluindolo alla concentrazione appropriata nella soluzione al 5% di BSA.

E avvolgere la camera umida in un foglio poiché alcuni anticorpi secondari sono sensibili alla luce. Incubare le larve con la soluzione di anticorpi secondari a 25 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione con l'anticorpo secondario, sciacquare le larve in una sola volta PBT per 30 minuti sostituendo il tampone ogni 10 minuti e procedere al montaggio e alla visualizzazione delle larve sezionate prima di montare la lava sul vetrino.

Prepara il vetrino stendendo due linee verticali di smalto al centro con uno spazio abbastanza grande da consentire l'appoggio di un vetrino coprioggetti come mostrato nel diagramma. Lascia asciugare completamente lo smalto quando lo smalto si è asciugato. Posizionare una goccia di tampone di montaggio nello spazio tra le linee verticali dello smalto sulla diapositiva, come mostrato in questa immagine.

La slitta è ora pronta per il montaggio. Recupera le larve dopo l'ultima volta PBT. Sciacquare e rimuovere delicatamente i perni laterali da una lava.

Fare attenzione a non strappare accuratamente la cuticola. Rimuovere i due perni rimanenti e raccogliere la lava con una pinza e posizionarla sul vetrino preparato. Assicurati che la lava non sia capovolta e sia orientata ventrale.

Con il lato rivolto verso l'alto, posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti sulla parte superiore e sigillare i bordi con lo smalto per unghie, come illustrato qui. Le larve sono ora pronte per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza. Questa immagine rappresentativa è di una lava di tipo selvatico colorata con anticorpi contro la proteina vescicale sinaptica, la proteina della stringa di cistina.

I nervi segmentali della lava sono macchiati in modo uniforme. Qui. Una lava mutante di proteina motoria è stata colorata con anticorpi contro CSP. I nervi segmentali mostrano accumuli massicci che si colorano brillantemente per il CSP.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere i nervi segmentali attaccati al cervello e di mantenere intatti i muscoli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare. Fissare un terzo immunocolorante e avviare i nervi segmentali larvali per studiare il trasporto assonale utilizzando un microscopio a fluorescenza.