Induzione e Valutazione della ricombinazione Classe Switch in depurata cellule B murini

Durante la risposta immunitaria umorale, le cellule B attivate dall'antigene proliferano e secernono anticorpi man mano che la risposta progredisce. L'ISOTIPO anticorpale I GM predefinito viene sostituito con gli isotipi più diversificati IgG, IgA o IgE per valutare la proliferazione e il class switching. Le cellule B spleniche vengono isolate in vitro da un topo sperimentale mediante separazione cellulare magnetica.

Le cellule vengono colorate con il colorante fluorescente CFSE per monitorare la proliferazione, che viene stimolata dal trattamento con LPS batterico. LPS induce anche il passaggio di classe all'isotipo IgG3, che insieme alla proliferazione può essere monitorato mediante citometria a flusso. Oggi vi mostrerò una tecnica per l'isolamento e l'attivazione di cellule B spleniche pure. Questa tecnica può essere utilizzata per analizzare la ricombinazione del passaggio di classe e la proliferazione in vitro, e può anche essere impiegata per rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunità delle cellule B, tra cui la funzione e la regolazione della citidina deaminasi indotta dall'attivazione.

Iniziare immergendo un topo eutanasizzato nell'etanolo al 70%. L'animale deve avere un'età compresa tra le otto e le dodici settimane. Per garantire una completa maturazione del sistema immunitario, utilizzare forbici sterili per praticare un'incisione attraverso la cute e il muscolo della regione ipocondriaca sinistra dell'addome. Usare le forbici o una pinza per rimuovere la milza dai tessuti adiacenti.

Successivamente, tagliarla in tre pezzi grandi in PBS. Quindi, utilizzando l'estremità di gomma dello stantuffo di una siringa da un millilitro, schiacciare delicatamente la milza attraverso un filtro cellulare da 70 micron nel PBS. Assicurarsi di eseguire un movimento di spinta piuttosto che un movimento di macinazione.

Poiché la macinazione può provocare la rottura di cellule proliferanti più grandi, centrifugare le cellule a non più di 350 G per cinque minuti. Quindi risospendere il pellet in PBS.

Contare le cellule sospese nuovamente utilizzando un emocitometro in un tubo sterile di polistirene da cinque millilitri. Preparare una sospensione di uno per 10 alla ottava cellule per millilitro in PBS con siero normale di ratto al 5%. È possibile aggiungere un massimo di due millilitri a ciascun tubo.

Successivamente, aggiungere 50 microlitri di EP per la selezione negativa. Cocktail di arricchimento delle cellule B murine per ogni millilitro di cellule. Quindi chiudere i tubi e collocarli in frigorifero per 15 minuti.

Aggiungere 100 microlitri di cocktail di selezione EP biotinato per ogni millilitro di cellule. Chiudere i tubi e collocarli in frigorifero per 15 minuti dopo l'incubazione con la miscela di nanoparticelle magnetiche EP del cocktail di selezione biotinato, quindi aggiungere 100 microlitri per ogni millilitro di cellule. Pipettare la miscela, chiudere i tubi e collocarli in frigorifero per cinque minuti.

Portare la soluzione a 2,5 millilitri con PBS e posizionare in un magnete da centrifuga. Per cinque minuti, capovolgere il magnete nel tubo e versare rapidamente in un nuovo tubo di polistirene. Non agitare il tubo poiché le cellule negativamente selezionate saranno legate magneticamente alle pareti del tubo. Per aumentare ulteriormente la purezza della sospensione cellulare, posizionare il nuovo tubo di cellule nel magnete per cinque minuti, quindi versare nuovamente in un tubo nuovo.

Questo passaggio potrebbe ridurre il recupero cellulare complessivo. La purezza delle cellule B può essere valutata mediante analisi citofluorimetrica dei marcatori di superficie delle cellule B. Dopo l'arricchimento, più del 95% delle cellule dovrebbe essere positivo per B due 20.

Risospendere le cellule isolate in PBS caldo integrato con BSA allo 0,1%, a una concentrazione finale di un milione di cellule per millilitro, a partire da una soluzione madre di CFSE a cinque millimoli, diluita in dimetilsulfossido sterile. Aggiungere due microlitri per ogni millilitro di cellule nel tubo. Il CFSE viene utilizzato per monitorare la divisione cellulare delle cellule stimolate.

Un processo fondamentale per il cambio di isotipo. Una concentrazione finale di 10 micromolari è ottimale per la colorazione delle cellule B primarie. Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti al buio.

Si noti che il CFSE è sensibile alla luce e, se possibile, deve essere mantenuto al buio. Al termine dell'incubazione, neutralizzare la colorazione aggiungendo un volume equivalente di siero di vitello bovino alle cellule e incubando sul ghiaccio per cinque minuti. Per lavare le cellule, aggiungere nei tubi mezzo di coltura in un volume almeno cinque volte superiore a quello del mezzo presente, al fine di contrastare la viscosità del siero di vitello bovino e consentire la formazione di un pellet cellulare; quindi centrifugare a 350 G. Lavare le cellule altre due volte con mezzo di coltura; le cellule sono ora pronte per la stimolazione.

Preparare il mezzo di coltura per linfociti B in vitro aggiungendo al mezzo RPMI 1640 siero bovino fetale al 10% ed etanolo Beto me capita a 50 micromolar. Successivamente, preparare il mezzo di stimolazione aggiungendo LPS a una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro. Aliquotare 125 microlitri del mezzo di stimolazione in ogni pozzetto di una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti con fondo piatto.

Preparare le cellule B marcate con CFS E in mezzo di coltura senza LPS a una concentrazione finale di 3,2 × 10⁶ cellule per millilitro. Aggiungere 125 microlitri di sospensione cellulare alle pozzette contenenti il mezzo di stimolazione e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Ogni pozzetta contiene ora 400.000 cellule in una concentrazione finale di LPS di 25 microgrammi per millilitro.

Questo garantisce livelli ottimali di proliferazione cellulare e commutazione di classe. Sebbene si possano apportare modifiche a questi valori secondo necessità, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 72-96 ore. Dopo 48 ore, ammassi di grandi linfociti B in proliferazione saranno chiaramente visibili al microscopio per osservare la commutazione di classe.

Rimuovere le cellule dall'incubatore e lavarle due volte in un millilitro di buffer di marcatura per prevenire la marcatura anticorpale non specifica. Pellettare le cellule centrifugandole a 350 ×g. Successivamente, risospendere le cellule in 100 microlitri di buffer di marcatura contenente 5% di siero murino normale e un microgrammo di bloccante FC per milione di cellule e incubare per 15 minuti sul ghiaccio senza lavaggio. Aggiungere un anticorpo secondario anti-US IgG marcato con fluorocromo a una concentrazione di un microgrammo per milione di cellule, incubare per 30 minuti sul ghiaccio, lavare le cellule due volte e risospendere in duecento fino a 300 microlitri di buffer di marcatura.

Le cellule sono ora pronte per essere valutate mediante citometria a flusso. Il CFSE viene eccitato in modo ottimale a 492 nanometri da un laser ad argon e emette a 517 nanometri. Lo spettro di eccitazione e di emissione dell'anticorpo IgG tre dipende dal colorante fluorescente coniugato.

Dopo l'arricchimento magnetico, la sospensione cellulare dovrebbe apparire come una popolazione omogenea di piccole cellule circolari indistinguibili. Dopo 48-72 ore di stimolazione, saranno chiaramente visibili ammassi isolati di cellule ingrandite in proliferazione. Una grande parte delle cellule non proliferanti apparirà piccola e granulare mentre andranno incontro ad apoptosi.

La CSR può normalmente essere rilevata ai livelli più elevati tra 72 e 96 ore dopo la stimolazione, prima che la maggior parte delle cellule inizi a morire. A questo stadio, le cellule dovrebbero aver subito un certo numero di divisioni cellulari, con le cellule commutate che compaiono nella popolazione delle cellule figlie successive. Seguendo questi protocolli, altre tecniche come l'RNA, l'inattivazione genica mediata da AI possono essere utilizzate per studiare l'effetto di qualsiasi gene sulla funzione di un ID e sul processo di ricombinazione per cambio di classe.