Iniezione intracranica di adeno-associato vettori virali

Qui vi presentiamo l'iniezione intracranica di vettori AAV per la marcatura fluorescente di neuroni e glia nella corteccia visiva.

I vettori virali possono essere utilizzati per esprimere proteine fluorescenti in specifici sottogruppi di cellule nei tessuti. Qui un virus che esprime proteine ingegnerizzate viene introdotto nella corteccia visiva primaria del cervello eseguendo prima una piccola craniotomia su quest'area. Successivamente, una micropipetta di vetro viene calata nel cervello e un vettore virale associato al dente viene iniettato nel cervello e il sito chirurgico viene chiuso.

Una volta che l'animale si è ripreso, l'imaging può essere eseguito per seguire il destino delle cellule marcate in fluorescenza in vivo o in sezioni cerebrali. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'etichettatura con coloranti fluorescenti e le linee di topi transgenici, sono che può mirare a singoli tipi di cellule ed è meno costosa e dispendiosa in termini di tempo rispetto alla creazione di una linea transgenica. L'uso di vettori virali adeno-associati è approvato per il livello di biosicurezza uno o BSL uno.

Qui, un camice da laboratorio e guanti saranno indossati in conformità con le procedure per la manipolazione degli agenti BSL uno iniziare preparando un armadio di biosicurezza di classe due per il virus citante Ali. Ciò preserverà l'attività del virus evitando ripetuti, congelamenti e scongelamenti. Svuotare la cabina di biosicurezza da eventuali oggetti non necessari e sterilizzare la superficie con etanolo al 70%.

Posizionare un becher contenente una soluzione di candeggina al 10% nella cabina di biosicurezza per raccogliere i rifiuti contaminati da virus associati ai denti. Posizionati anche tubi sterili da 0,5 millilitri e un contenitore di ghiaccio secco. Scongelare il brodo virale con ghiaccio all'esterno della cappa di biosicurezza.

Agitare il virus e aprire il tubo all'interno del cappuccio. Pipettare il volume desiderato in una provetta da 0,5 millilitri. Chiudere il tubo e metterlo nel ghiaccio secco.

Per eseguire il flashing, congelare il virus quando tutto il virus è stato aliquotato. Smaltire la provetta vuota e i puntali della pipetta nel contenitore per rifiuti di candeggina al 10%. Rimuovere il contenitore dei rifiuti dal cofano.

Aggiungere altro 10% di candeggina. Attendi da cinque a 10 minuti, quindi versa la candeggina nel lavandino. Smaltire tutti i rifiuti di plastica in un contenitore a rischio biologico.

Secondo i protocolli istituzionali, pulire tutte le attrezzature o le superfici che sono entrate in contatto con il virus con il 10% di candeggina. Rimuovere e gettare i guanti. Conservare le aliquote in un congelatore a meno 80 gradi Celsius.

Coprire l'area chirurgica con carta assorbente da banco da laboratorio. Lo strumento chirurgico deve essere sterile e l'intervento chirurgico deve essere eseguito in condizioni asettiche. Coprire l'area adiacente all'area chirurgica con carta assorbente da banco da laboratorio.

Quest'area sarà dedicata al caricamento delle micro pipette con virus. Mettere un'aliquota del virus in un contenitore di ghiaccio e lasciarlo scongelare sul ghiaccio durante l'esecuzione dell'intervento, allestire un contenitore di rifiuti di candeggina al 10% nell'area dedicata alla manipolazione dei virus per smaltire eventuali puntali di pipette o altri oggetti che entrano in contatto con il virus. Tirare una micropipetta troll in filo di vetro fino a un diametro del puntale di circa 20 micron.

Posizionare una piccola goccia di olio minerale sull'estremità smussata della micropipetta e inserire lo stantuffo del filo fornito con le micropipette. Fissare la micropipetta nel morsetto del braccio della micropompa. Usando le forbici chirurgiche.

Rimuovere i peli dalla sommità della testa di un topo anestetizzato. Quindi fissare il mouse in uno stereo attacchi. Bagnare la testa con etanolo e betadina per sterilizzare l'area.

Metti una goccia di unguento oculare al tobradex su ciascun occhio per mantenere gli occhi umidi durante l'intervento chirurgico. Fai un'incisione lungo la linea mediana della testa e tira indietro la pelle per esporre il cranio usando una pinza a punta fine. Rimuovere con cautela la plancia dal cranio.

Localizzare l'area da iniettare utilizzando le coordinate stereotassiche e contrassegnare il cranio con una penna chirurgica. Usando un trapano dentale con una fresa da 1,4 millimetri, assottigliare un'area del cranio, di circa due millimetri di diametro fino a quando il cranio non si rompe. Dividendo l'area assottigliata in più segmenti durante questa procedura.

Applicare soluzione fisiologica sterile per mantenere umido il cranio. Eseguire una craniotomia rimuovendo delicatamente i segmenti sottili del cranio utilizzando una pinza a punta extra fine. Metti una salvietta Kim sul coperchio del tubo del virus.

Quindi aprire il tubo per un'iniezione di un microlitro. Pipettare 1,5 microlitri su un pezzetto di paraform. Quindi, posizionare la punta della micropipetta nel brodo virale ed estrarre manualmente lo stantuffo.

Se si riscontrano difficoltà nell'aspirare il materiale virale nella micropipetta, la punta può essere leggermente allargata perforando una salvietta kim con la micropipetta per rompere una piccola parte del vetro, abbassare il braccio della micropompa sullo stantuffo fino a quando una piccola quantità di virus non viene dissipata dalla punta della micropipetta. Rimuovere questa goccia con un applicatore con punta di cotone e gettare l'applicatore in un contenitore per rifiuti. Applicare una goccia di olio minerale sulla punta della micropipetta per evitare l'intasamento mentre la micropipetta viene abbassata nel cervello, utilizzando le coordinate stereotassiche X e Y posiziona la micropipetta sull'area da iniettare.

In questo esperimento, le coordinate stereotassiche utilizzate per localizzare la corteccia visiva primaria sono 2,7 millimetri di torema posteriore e 2,5 millimetri lateralmente alla linea mediana. Abbassare molto lentamente la micropipetta a una velocità approssimativa di un millimetro al minuto. Alla profondità desiderata, inserire i parametri di iniezione desiderati nella scatola di controllo della micropompa CYS micro four.

Per questo esperimento, un microlitro in 10 minuti sarà utilizzato come velocità di iniezione. Inizi l'iniezione. Al termine dell'iniezione.

Lasciare riposare la pipetta per uno o due minuti per evitare l'afflusso di virus durante la rimozione. Trascorso questo periodo, molto lentamente, rimuovere la micro pipetta dal cervello, suturare il cuoio capelluto e sigillarlo con colla per tessuti. Lasciare che l'animale si riprenda sotto una lampada termica fino a quando non sta deambulando.

Quindi rimettilo nella sua gabbia. Gli esperimenti di imaging possono essere eseguiti giorni o settimane dopo l'iniezione virale. Dopo l'intervento chirurgico e l'iniezione, sciacquare la micropipetta con candeggina al 10% e gettarla in un contenitore per oggetti taglienti.

Aggiungere altro 10% di candeggina nel contenitore dei rifiuti. Attendi da cinque a 10 minuti, quindi versa la candeggina nel lavandino. Smaltire i rifiuti in un contenitore a rischio biologico secondo le linee guida istituzionali.

Gettare la carta da banco da laboratorio in un contenitore a rischio biologico. Pulisci tutte le superfici e gli strumenti che potrebbero essere entrati in contatto con il virus. Con il 10% di candeggina, il virus inutilizzato può essere congelato.

Ancora una volta, tenendo presente che ripetuti cicli di congelamento causano la degradazione del virus. Questa immagine mostra i neuroni trasdotti dopo l'iniezione del sierotipo del virus doppietto, a filamenti, adeno-associato. Uno. Il corpo cellulare e i dendriti prossimali e distali sono chiaramente visibili in sezioni fisse.

Qui viene mostrata l'etichettatura tipica di un'iniezione virale intracranica nella corteccia visiva primaria. Si noti l'entità della diffusione virale, nonché i neuroni marcati, la glia e i processi. L'iniezione di vettore virale nell'ippocampo si traduce anche in cellule marcate chiaramente visibili come mostrato in questa immagine, Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prestare molta attenzione quando si abbassa e si alza il microFIT nel cervello. Non dimenticare che lavorare con i vettori virali può essere estremamente pericoloso. Seguire sempre le procedure corrette per la manipolazione degli agenti a rischio biologico stabilite dai Centers for Disease Control.

Si prega di consultare l'ufficio per la sicurezza dell'istituto per l'approvazione e la guida prima di eseguire esperimenti con virus.