Name: Iniezione intracranica di adeno-associato vettori virali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-17T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Impara l'iniezione intracranica di vettori virali adeno-associati per marcare neuroni e glia fluorescenti nella corteccia visiva. Questa tecnica consente l'imaging in vivo delle dinamiche cellulari.

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Questo lavoro è stato reso possibile da finanziamenti del NIH (EY012977), un Premio alla Carriera nel Scienze Biomediche dal Fondo Burroughs Wellcome, la Fondazione Whitehall, e la Fondazione Sloan (AKM).

1. Virus Manipolazione e stoccaggio <ol><li> Adeguata protezione e le tecniche di manipolazione devono essere scelti in base al livello di biosicurezza del virus da utilizzare. Queste pratiche possono essere trovati in biosicurezza in microbiologiche e Biomedica Laboratori 5 ° edizione, disponibile sul sito del CDC ( <a href="http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm">http://www.cdc.gov/od/OHS/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm</a> ). L&#39;uso di vettori AAV è approvato per la Biosicurezza Livello 1 (BSL-1). Per l&#39;esperimento mostrato qui, un camice e guanti da indossare durante la manipolazione del virus, secondo le procedure per la gestione BSL-1 agenti. </li><li> Per preservare l&#39;attività del virus è meglio dividerlo in piccole aliquote per evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. </li><li> Preparare una biosicurezza Cabinet (BSC) Classe II per aliquoting virus deselezionando la BSC di tutti gli oggetti inutili e sterilizzare la superficie con il 70% EtOH. Posizionare un bicchiere contenente una soluzione di candeggina al 10% nel cappuccio per la raccolta di AAV-rifiuti contaminati. Anche messo in BSC sono sterili tubi da 0,5 ml e un contenitore di ghiaccio secco. </li><li> Disgelo magazzino virale sul ghiaccio al di fuori del BSC. </li><li> Vortex virus e aprire il tubo all&#39;interno del BSC. </li><li> Pipettare il volume aliquota desiderata (ad esempio 5 mL) in una provetta da 0,5 ml, chiudere il tubo e posizionarlo nel ghiaccio secco di flash-congelare il virus. </li><li> Quando tutti i virus è stato aliquotati, smaltire il tubo di virus e puntali nel contenitore dei rifiuti contenente il 10% di candeggina. </li><li> Rimuovere il contenitore dal cofano e aggiungere ulteriori candeggina al 10%, poi versare la candeggina nel lavandino. Smaltire i rifiuti in plastica in un contenitore rischio biologico secondo le istruzioni del funzionario biosicurezza del vostro Istituto. </li><li> Pulire le attrezzature e superfici che è venuto a contatto con il virus con il 10% di candeggina. Gettare i guanti. </li><li> Aliquote da conservare in freezer -80 ° C. </li></ol> 2. Chirurgia <ol><li> Coprire l&#39;area chirurgica con carta assorbente da banco di laboratorio. Strumenti chirurgici devono essere sterilizzati e chirurgia effettuata in condizioni asettiche secondo biosicurezza del vostro istituto e le linee guida sull&#39;uso degli animali. </li><li> Scegliere una zona adiacente all&#39;area chirurgica che sarà dedicata al caricamento dei micropipette con il virus, e coprire con carta assorbente da banco di laboratorio. Inserire un aliquota del virus in un contenitore di ghiaccio in questo settore, e permettono al virus di disgelo sul ghiaccio, come l&#39;intervento è in corso. </li><li> Installazione di un contenitore dei rifiuti del 10% candeggina nell&#39;area dedicata trattamento del virus per lo smaltimento di puntali, ecc che vengono a contatto con il virus. </li><li> Tirare una micropipetta Wiretrol vetro a un diametro punta di circa 20 micron. Mettere una piccola goccia di olio minerale sulla punta smussata della micropipetta e inserire lo stantuffo cavo fornito con il micropipette. </li><li> Fissare la micropipetta nel morsetto del braccio micropompa. </li><li> Iniettare un mouse con buprenorfina per via sottocutanea alla dose di 0,5 mg / kg. Anestetizzare il mouse con Avertin tramite iniezione intraperitoneale con una dose di 200 mg / kg e togliere i capelli dalla parte superiore della testa con le forbici chirurgiche, avendo cura di lasciare margini abbastanza grandi per evitare che i capelli di entrare l&#39;incisione. </li><li> Fissare una coperta riscaldamento alla base di un stereotax di mantenere una temperatura corporea di 37 ° C durante tutto l&#39;intervento e fissare il mouse nella stereotax. </li><li> Bagnano la testa con tre scrub alternati di etanolo e betadine per sterilizzare la zona. </li><li> Mettere una goccia di unguento oculare Tobradex su ciascun occhio a tenere gli occhi umidi durante l&#39;intervento. </li><li> Fare un&#39;incisione lungo la linea mediana della testa e tirare la pelle torna a esporre il cranio. </li><li> Rimuovere con attenzione la fascia dal cranio con punta fine pinze. </li><li> Individuare l&#39;area per essere iniettato usando le coordinate stereotassica e segnare il cranio con una penna chirurgica. </li><li> Utilizzando un trapano per l&#39;odontoiatria a 1,4 millimetri radica, sottile una zona del cranio circa 2mm di diametro fino a quando le crepe del cranio, dividendo l&#39;area diluito in diversi segmenti. </li><li> In tutta questa procedura, tenere il cranio umido con le applicazioni di soluzione fisiologica sterile. </li><li> Eseguire una craniotomia con delicatezza eliminando i segmenti cranio diluito con pinze a punta extra-fine. </li></ol> 3. Iniezione di preparazione <ol><li> Con un KimWipe posto sopra il coperchio, aprire il tubo da virus e pipetta 1.5uL (per una iniezione 1UL) di virus su un piccolo pezzo di parafilm. </li><li> Posizionare la punta della micropipetta in azioni virali e ritirare manualmente lo stantuffo. In caso difficoltà disegno magazzino virale nel micropipetta, la punta può essere allargato leggermente pungente essere uno KimWipe con la micropipetta per rompere una piccola parte del vetro. </li><li> Micropompa braccio inferiore sul stantuffo fino a quando una piccola quantità di virus è dissipato dalla punta della micropipetta. Rimuovere questa piccola goccia con un cotton-fioc e applicatore scartare in ericontenitore e. </li><li> Applicare una goccia di olio minerale per la punta della micropipetta per evitare l&#39;intasamento come la micropipetta è abbassato nel cervello. </li></ol> 4. Virus iniezione <ol><li> Utilizzo di X e Y stereotassica coordinate, la posizione del micropipetta sopra la zona da iniettare. In questo esperimento, il stereotassica coordinate utilizzato per individuare corteccia visiva primaria sono posteriori al bregma 2,7 millimetri e 2,5 mm laterale alla linea mediana. Molto lentamente abbassare la micropipetta (ad un tasso di circa 1mm/1minute) nella posizione corretta Z. </li><li> Immettere i parametri di iniezione desiderato nel controller SYS Micro4 casella micropompa e avviare l&#39;iniezione. Per questo esperimento, 1 microlitro in 10 minuti sarà utilizzato come un tasso di iniezione. </li><li> Quando l&#39;iniezione è terminata, lasciare la pipetta riposare per 1-2 minuti per evitare di efflusso del virus durante la rimozione. Dopo questo periodo, molto lentamente la micropipetta rimuovere dal cervello (tasso come sopra). </li><li> Sutura al cuoio capelluto e sigillare con la colla dei tessuti. Iniettare l&#39;animale con buprenorfina per via sottocutanea alla dose di 0,1 mg / kg ogni 8-12 ore per i prossimi 72 ore, o fino a quando l&#39;animale è mostrano segni di dolore. Permettere agli animali di recuperare sotto una lampada di calore fino a quando non è deambulazione e pronto per essere restituito alla sua gabbia. Esperimenti di imaging possono essere avviate dopo il tempo di incubazione desiderato (giorni o settimane dopo l&#39;iniezione virale). </li></ol> 5. Pulizia <ol><li> Sciacquare la micropipetta con il 10% di candeggina e smaltirlo in un apposito contenitore. </li><li> Smaltire i contenitori dei rifiuti nello stesso modo come Sezione 1. </li><li> Eliminare la carta banco di laboratorio in bin rischio biologico e pulire tutte le superfici e gli strumenti che possano essere venuti in contatto con il virus con il 10% di candeggina. </li><li> Virus non utilizzati possono essere ricongelato, tenendo presente che ripetuti cicli gelo / disgelo causa la degradazione del virus. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Trasdotte neurone dopo l&#39;iniezione del doppio filamento del virus adeno-associato sierotipo 1 (dsAAV S1) portando la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore CMV. Il corpo della cellula e dendriti prossimale e distale sono chiaramente visibili in sezioni fisse fotografato con un microscopio epifluorescente. Barra di scala = 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Etichettatura tipici di una iniezione di virus intracranica in corteccia visiva primaria con S1 dsAAV indicando la misura della propagazione virale così come neuroni marcati, glia e processi. Barra di scala = 250 micron. <img src="/files/ftp_upload/2140/2140fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Etichettatura delle cellule dell&#39;ippocampo con S1 dsAAV. Barra di scala = 250 micron. Queste cifre sono adattate da Lowery et al. 2009 1

<ol><li>Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O'Malley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nat Genet. 8, 148-154 (1994).</li>
<li>Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfer+efficiency+in+the+murine+striatum+and+an+orthotopic+glioblastoma+tumor+model%2C+using+AAV-7-+and+AAV-8-pseudotyped+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors.</a> Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).</li>
<li>Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+the+brain%3A+duration+and+modulation+of+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression.</a> Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).</li>
<li>Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+long-term+labeling+of+cells+in+the+developing+and+adult+rodent+visual+cortex+using+double-stranded+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors.</a> Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).</li>
</ol>

I protocolli di sperimentazione animale e sono stati approvati dalla University of Rochester University commissione Animal Resources (UCAR) in conformità con la Politica PHS sulla cura umanitaria ed uso di animali da laboratorio.

Virale mediata consegna del gene ha un grande potenziale per lo studio di processi neurologici e trattamento dei disturbi cerebrali 1,2,3. La grande versatilità di questa tecnica può anche essere sfruttato per un&#39;etichetta fluorescente cellule per l&#39;imaging sia in vitro che in vivo 4. Qui mostriamo una procedura dettagliata per la trasduzione di neuroni e glia nella corteccia visiva del mouse utilizzando un doppio filamento del virus adeno-associazione che esprime maggiore proteina...

<table><tbody><tr><td>Adattatore per topo e ratto neonato St&amp;#8211;lting</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td>Al posto di questo può essere utilizzato un stereotasso standard per fissare gli animali durante l'intervento chirurgico</td></tr><tr><td>Forbici Bonn extra fini, 8,5 cm, punta dritta, lama 13 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette per medicazione oculare, 10 cm, larghezza della punta 0,5 mm, curve</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont n. 5/45 - punta standard Dumoxel, 11 cm, angolate</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Pinzette a punta extrafine per eseguire la craniotomia</td></tr><tr><td>Pinzette a modello standard, dritte, punta 2,5 mm x 1,35 mm, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Centralina di controllo Microtorque e impugnatura Tech2000</td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000ON/OFF</td><td>Trapano dentale</td></tr><tr><td>Frese in acciaio inossidabile per microtrapano, diametro della punta 1,4 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-14</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Wiretrol, per erogare 1-5 µL</td><td>VWR international</td><td>5-000-1001 o 53480-287</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>VWR international</td><td>29447-338</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore manuale e base inclinabile (per destri)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301-M3-R</td><td>Utilizzato per determinare le coordinate stereotassiche</td></tr><tr><td>UltraMicroPump (UMP3) (uno) con controller SYS-Micro4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>Materiali per sutura</td><td>VWR international</td><td>95056-952</td><td></td></tr><tr><td>Tiratore di micropipette P-97 Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Tobradex</td><td></td><td></td><td>Disponibile presso i servizi veterinari della propria istituzione&amp;rsquo;</td></tr></tbody></table>

iniezione intracranica di adeno-associato vettori virali

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranica iniezione di vettori virali ingegnerizzati per esprimere una proteina fluorescente è una tecnica di etichettatura versatile per la visualizzazione di sottoinsiemi di cellule nelle differenti regioni del cervello sia in vivo che in sezioni cerebrali. A differenza della iniezione di coloranti fluorescenti, etichettatura virale offre targeting di tipi di cellule individuali ed è meno costoso e richiede tempo che stabilire linee di topi transgenici. In questa tecnica, un virale adeno-associato (AAV) vettore viene iniettato intracranially usando le coordinate stereotassica, una micropipetta e una pompa automatica per la consegna precisa AAV alla zona desiderata con minimo danno al tessuto circostante. Parametri di iniezione può essere adattata alle singole sperimentazioni regolando l&#39;età degli animali a velocità di iniezione, la posizione di iniezione, il volume di iniezione, di iniezione, AAV sierotipo e il promotore di guida l&#39;espressione genica. A seconda delle condizioni scelte, virale indotta l&#39;espressione del transgene può permettere la visualizzazione di gruppi di cellule, cellule singole o multa processi cellulari, fino al livello delle spine dendritiche. L&#39;esperimento qui rappresenta una iniezione di AAV a doppio filamento che esprimono la proteina fluorescente verde per l&#39;etichettatura dei neuroni e glia nella corteccia visiva primaria del mouse.

Qui vi presentiamo l&#39;iniezione intracranica di vettori AAV per la marcatura fluorescente di neuroni e glia nella corteccia visiva.

Iniezione intracranica di adeno-associato vettori virali

L'iniezione intracranica di vettori virali progettati per esprimere una proteina fluorescente è una tecnica di marcatura versatile per la visualizzazione di specifici...

I vettori virali possono essere utilizzati per esprimere proteine fluorescenti in specifici sottoinsiemi di cellule nei tessuti. Qui un virus che esprime proteine ingegnerizzate viene introdotto nella corteccia visiva primaria del cervello eseguendo prima una piccola craniotomia su questa area. Successivamente, una micropipetta di vetro viene abbassata nel cervello e un vettore virale associato ai denti viene iniettato nel cervello, quindi il sito chirurgico viene chiuso.Dopo il recupero dell'animale, è possibile eseguire l'acquisizione di immagini per seguire il destino delle cellule marcate con fluorescenza in vivo o in sezioni cerebrali. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'etichettatura con coloranti fluorescenti e le linee di topi transgenici, sono la possibilità di indirizzare tipi cellulari specifici e il fatto che risulti meno costosa e meno dispendiosa in termini di tempo rispetto all'allestimento di una linea transgenica. L'uso di vettori virali adeno-associati è approvato per il livello di sicurezza biologica uno, o BSL uno.Qui, verranno indossati camice da laboratorio e guanti in conformità con le procedure per la manipolazione di

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Neuroscience

Neuroscienze

Fonte: Pereira, M. et. al., Riprogrammazione diretta in vivo delle cellule gliali residenti in interneuroni mediante iniezione intracerebrale di vettori virali. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra l'iniezione stereotassica di un virus adeno-associato nella corteccia cerebrale di un topo transgenico per fornire la riprogrammazione neuronale Cre-dipendente e i geni reporter fluorescenti nelle cellule gliali.

Iniezione stereotassica di vettori virali per la riprogrammazione delle cellule gliali in un modello murino

Fonte: Li, D., et al. Iniezione intratecale diretta di virus adeno-associati ricombinanti in topi adulti. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra la procedura per l'iniezione intratecale di virus adeno-associati (AAV) nel liquido cerebrospinale (CSF) di un topo sveglio, coprendo la preparazione della siringa, l'allineamento spinale e l'inserimento preciso dell'ago. Questo metodo convalida la somministrazione genica mirata, supportando il suo potenziale per le terapie del SNC.

Somministrazione intratecale di virus in un modello murino per il trattamento delle malattie del sistema nervoso centrale

Fonte: Grames, M. S., et al. Metodi e suggerimenti per la somministrazione endovenosa di virus adeno-associato ai ratti e valutazione della trasduzione del sistema nervoso centrale. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra l'iniezione nella vena caudale del virus adeno-associato ricombinante (AAV) nei ratti. Dopo l'iniezione nella vena laterale della coda, il virus entra nel flusso sanguigno, circola attraverso il cuore e raggiunge il cervello, dove entra nei neuroni e facilita la produzione di...

 Somministrazione endovenosa di vettori virali adeno-associati ricombinanti in un modello di ratto 

Qui dimostriamo una tecnica per la trasduzione neuronale diffusa mediante iniezione intraventricolare di virus adeno-associato nel cervello del topo neonatale.  Questo metodo fornisce un modo rapido e semplice per ottenere l'espressione permanente dei transgeni veicolati viralmente.

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

Il cervello è un sito unico con qualità che non sono ben rappresentati da in vitro o analisi ectopiche. Modelli di mouse ortotopico con caratteristiche di localizzazione e di crescita riproducibili possono essere attendibilmente creati con iniezioni intracraniche utilizzando uno strumento di fissazione stereotassico e una pompa a siringa a bassa pressione.

Creazione anatomicamente accurati e riproducibili intracranica xenotrapianti di tumori cerebrali umani

Metodi per una consegna del gene su larga scala del sistema nervoso centrale nel ratto sono coperti. In questo esempio, lo scopo è quello di imitare una malattia che colpisce l'intero midollo spinale. La trasduzione diffusa può essere utilizzata per fornire una proteina terapeutica al SNC da un'amministrazione periferica, una tantum.

Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale

Qui presentiamo una tecnica di iniezione intratecale diretto utilizzo 1% lidocaina cloridrato in una soluzione virale per garantire una consegna efficiente virus adeno-associato ai piccoli animali e stabilire un sistema di scoring per predire l'efficienza di trasduzione in zona centrale sistema nervoso secondo il grado della debolezza transitoria indotta da lidocaina.

Diretto iniezione intratecale di ricombinanti Virus Adeno-associato in topi adulti

In questo manoscritto, l'iniezione subcongiuntivale è dimostrata come un valido metodo di somministrazione vettoriale per i tessuti oculari nei topi utilizzando un sistema di iniezione costituito da una pompa a siringa per infusione/prelievo e una siringa rimovibile a tenuta di gas accoppiata con aghi di microiniezione. Questo sistema di iniezione è adattabile anche ad altre vie di somministrazione intraoculare.

Somministrazione subcongiuntivale di vettori virali adeno-associati in modelli di piccoli animali

Viene descritta una procedura chirurgica per eseguire iniezioni nella cisterna lombare del ratto giovane. Questo approccio è stato utilizzato per la somministrazione intratecale di vettori di terapia genica, ma si prevede che questo approccio possa essere utilizzato per una varietà di terapie, tra cui cellule e farmaci.

Somministrazione intratecale di vettori in ratti giovani tramite iniezione nella cisterna lombare

Qui descriviamo in dettaglio un protocollo ottimizzato per l'iniezione laterale della vena di coda nel topo per somministrare sistemicamente il virus adeno-associato (AAV) nei topi adulti. Inoltre, descriviamo i protocolli dei saggi comunemente usati per valutare la trasduzione di AAV.

Somministrazione costante di virus adeno-associato tramite iniezione laterale della vena di coda in topi adulti

Viene descritta una nuova tecnica per la somministrazione diffusa di virus adeno-associato che utilizza l'infusione di virus subaracnoideo. Questo metodo non solo garantisce una diffusa trasduzione dei neuroni neocorticali di topo negli strati superficiali, ma si traduce anche in un'espressione selettiva del transgene nei neuroni piramidali di quinto strato, anche quando si utilizza un promotore non selettivo.

Trasduzione diffusa dei neuroni neocorticali di topo mediante iniezione subaracnoidea di AAV2

Impara l'iniezione intracranica di vettori virali adeno-associati per marcare neuroni e glia fluorescenti nella corteccia visiva. Questa tecnica consente l'imaging in vivo delle dinamiche cellulari.

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